Toxoplasma gondii’nin Her Üç Dönemine Karşı Etkili MIC3 Proteininin Saccharomyces cerevisiae Tabanlı Rekombinant Protein Aşı Stratejisinde Kullanılması Amacıyla in silico Analizlerinin Gerçekleştirilmesi

Seren Kaplan; İrem Yavuz; Muhammet KARAKAVUK; Tuğba Karakavuk; Ceren Gül; Mervenur Güvendi; Hüseyin CAN; Aysu DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA; Cemal ÜN; Adnan Yüksel GÜRÜZ; Mert DÖŞKAYA

Toxoplasma gondii’nin Her Üç Dönemine Karşı Etkili MIC3 Proteininin Saccharomyces cerevisiae Tabanlı Rekombinant Protein Aşı Stratejisinde Kullanılması Amacıyla in silico Analizlerinin Gerçekleştirilmesi

Bildiriler > Özet Bildiri · 2023

Yazarlar: Seren Kaplan, İrem Yavuz, Muhammet KARAKAVUK, Tuğba Karakavuk, Ceren Gül, Mervenur Güvendi, Hüseyin CAN, Aysu DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA, Cemal ÜN, Adnan Yüksel GÜRÜZ, Mert DÖŞKAYA

23. Ulusal Parazitoloji Kongresi, Türkiye, Antalya, Ulusal, Poster, Özet Bildiri, 2023-2023, ss 225-227

Özet

Toxoplasma gondii, insan ve hayvanları enfekte edebilen protozoan bir parazittir. Seroprevalans raporlarına dünya nüfusunun üçte birinin enfekte olduğu düşünülmektedir. (1). Ayrıca, ekonomimizde oldukça önemli yeri olan küçükbaş hayvanlar da T. gondii enfeksiyonuna karşı oldukça duyarlıdır. Bu sebeple ekonomik anlamda T. gondii enfeksiyonunun dünyada önemli bir yeri vardır. Ek olarak, toksoplazmozis zoonozdur; küçükbaş hayvanlardaki enfeksiyon doğal koşullar altında insanlara bulaşabilmektedir (2). T. gondii paraziti apikompleksan bir parazittir ve büyük ölçüde zorunlu bir hücre içi replikasyon döngüsü oluşturan karmaşık yaşam döngülerine sahiptir. Bu nedenle T.gondii'ye karşı uygun bir aşı adayının geliştirilmesinde zorluklar yaşanmaktadır ve piyasada sadece koyunlarda kullanılabilen tek bir aşı yer almaktadır. Bu nedenle insanları ve hayvanları T. gondii enfeksiyonuna karşı korumaya yönelik güvenli ve etkili bir aşıya ihtiyaç duyulmaktadır (3,4). Rekombinant protein aşıları patojenin enfektif forma dönüşmesi riskini taşımaması, yüksek saflıkta ürün eldesinin mümkün olması hem hücresel hem humoral yanıtı uyarabilme yetenekleri nedeniyle aşı çalışmalarında tercih edilmektedirler (5). Rekombinant protein ekspresyon sıklıkla E. coli kullanılmaktadır. Ancak sistemlerinde post-translasyonel modifikasyonları yapabilme ve yetenekleri olmaması nedeniyle ökaryotik bir organizma olan mayalar E. coli’nin yerini almaktadır (6). Konvensiyonel olarak kullanılan Saccharomyces cerevisiae GRAS (genellikle güvenilebilir) statüsüne dahil olduğu için ekspresyon sistemi olarak tercih edilmektedir (7). T.gondii’ye karşı etkili güçlü aşıların geliştirilmesi gerekmektedir. Bu sebeple parazitin bütün yaşam döngülerinde ortak olan bir antijenin seçimi önemlidir. Rezai ve ark. tarafından yapılan incelemede MIC3 proteininin parazitin her üç döneminde eksprese edildiği ve yüksek immünojen etki gösterdiği ifade edilmektedir. Toksoplazmozise karşı geliştirilmesi hedeflenen bir aşı tasarımında birçok antijene kıyasla MIC3 proteini umut vadetmektedir (9). Bu sebeple bu çalışmada MIC3 proteininin aşı antijeni olarak kullanılması, S. cerevisiae’da ifade edilmesi amacıyla in silico analizlerin yapılması amaçlanmıştır. Öncelikle ToxoDB veri tabanından (https://toxodb.org/toxo/app) MIC3 aminoasit sekansı (ToxoDB: TGME49_319560) alınmıştır. MIC3 proteininin antijenitesi Vaxijen v2 server (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)(10), fizikokimyasal özellikleri Expasy Prothparam (https://web.expasy.org/protparam/) (11), allerjenitesi Algpred online server (http://crdd.osdd.net/raghava/algpred/) (12), ekstraselüler bölgesi TMHMM server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) (13), ikincil ve üçüncül yapıları sırasıyla I-TASSER server (https://zhanggroup.org/I-TASSER/) (14) ve SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (15) kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca, lineer ve no-lineer sırayla B hücre epitopları İmmün Epitop Veritabanı (IEDB: https://www.iedb.org/) altında çalışan Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 (16) ve Bcepred (http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred/) (17) ile belirlenmiştir. T hücre epitopları ise ANN 4.0 yöntemi kullanılarak ve insan gen havuzunda en sık rastlanan MHCI allelleri, NetMHCIIpan yöntemi kullanılarak MHCII allelleri ile belirlendi ve çıktılar yarı maksimal inhibitor konsantrasyonu (IC50) ve yüzdelik sıra değerlerine göre analiz edildi (16). MIC3 proteininin B ve T hücre epitopları tespit edildikten sonra post-translasyonel modifikasyon profilini belirlemek amacıyla NetNGlyc 1.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) (20), NetOGlyc 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetOGlyc/) (18), NetPhos 3.1 server (http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) (19) ve CSS-Palm Online Service (http://csspalm. biocuckoo.org/online.php) altında çalışan GPS-MSP server ve GPS-PAIL server (20) ile belirlendi. Ayrıca, MIC3’ün translasyon sonrası modifikasyon bölgelerinin yüzey erişilebilirliğini tahmin etmek amacıyla NetSurfP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/) (21) kullanıldı. Çalışmada yapılan analizler sonucunda MIC3 proteininin yüksek antijenite özellik gösteren, çözünür, allerjen olmayan ve memeli hücrelerinde yarılanma ömrü 30 saat olan ve stabil bir protein olduğu tespit edilmiştir. MIC3 proteinine ait 14 tane lineer B hücre epitopu ve 11 tane T hücre epitopu tespit edilmiştir. Ayrıca, N ve O glikozilasyon profiline bakılduğında ise 8 N-glikozilasyon bölgesi ve 28 Oglikozilasyon bölgesi olduğu tespit edilmiştir. Bu sebeple MIC3 post-translasyonel modifikasyon profili göz önüne alındığında proteinin doğru katlanma yapabilmesi için E. coli’ye kıyasla S. cerevisiae’nın konak ekspresyon sistemi olarak tercih edilmiştir. MIC3 proteini S. cerevisiae ekspresyon vektöründe eksprese edilmek üzere tasarlanmıştır. Anahtar kelimeler: MIC3, T. gondii, Rekombinant protein aşısı, Saccharomyces cerevisiae, biyoinformatik analiz ,KAYNAKLAR 1. Milne G, Webster JP, Walker M. Toxoplasma gondii: AnUnderestimated Threat? Trends Parasitol. 2020 Dec;36(12):959-969. doi: 10.1016/j.pt.2020.08.005. Epub 2020 Oct 1. PMID: 33012669. 2. Stelzer S, Basso W, Benavides Silván J, Ortega-Mora LM, Maksimov P, Gethmann J, Conraths FJ, Schares G. Toxoplasma gondii infection and toxoplasmosis in farm animals: Risk factors and economic impact. Food Waterborne Parasitol. 2019 Apr 3;15:e00037. doi: 10.1016/j.fawpar.2019.e00037. PMID: 32095611; PMCID: PMC7033994. 3. Gubbels MJ, Ferguson DJP, Saha S, Romano JD, Chavan S, Primo VA, Michaud C, Coppens I, Engelberg K. Toxoplasma gondii's Basal Complex: The Other Apicomplexan Business End Is Multifunctional. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Apr 29;12:882166. doi: 10.3389/fcimb.2022.882166. PMID: 35573773; PMCID: PMC9103881. 4. Wang HL, Li YQ, Yin LT, Meng XL, Guo M, Zhang JH, Liu HL, Liu JJ, Yin GR. Toxoplasma gondii protein disulfide isomerase (TgPDI) is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis. PLoS One. 2013 Aug 15;8(8):e70884. doi:10.1371/journal.pone.0070884. PMID: 23967128; PMCID: PMC3744524. 5. Karakavuk T, Gül C, Karakavuk M, Gül A, Erkunt Alak S, Can H, Ün C, Döşkaya M, Gürüz AY, Değirmenci Döşkaya A. Biotechnological Based Recombinant Protein Vaccines Developed Against Toxoplasmosis. Turkiye Parazitol Derg. 2022 Nov28;46(4):342-357. English. doi: 10.4274/tpd.galenos.2022.41636. PMID: 36444412. 6. Kesidis A, Depping P, Lodé A, Vaitsopoulou A, Bill RM, Goddard AD, Rothnie AJ. Expression of eukaryotic membrane proteins in eukaryotic and prokaryotic hosts. Methods. 2020 Aug 1;180:3-18. doi: 10.1016/j.ymeth.2020.06.006. Epub 2020 Jun 10. PMID: 32534131. 7. Parapouli M, Vasileiadis A, Afendra AS, Hatziloukas E. Saccharomyces cerevisiae and its industrial applications. AIMS Microbiol. 2020 Feb 11;6(1):1-31. doi: 10.3934/microbiol.2020001. PMID: 32226912; PMCID: PMC7099199. 8. Rezaei F, Sarvi S, Sharif M, Hejazi SH, Pagheh AS, Aghayan SA, Daryani A. A systematic review of Toxoplasma gondii antigens to find the best vaccine candidates for immunization. Microb Pathog. 2019 Jan;126:172-184. doi: 10.1016/j.micpath.2018.11.003. Epub 2018 Nov 3. PMID: 30399440. 9. Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics. 2007 Jan 5;8:4. doi: 10.1186/1471-2105-8-4. PMID: 17207271; PMCID: PMC1780059. 10. Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, Sanchez JC, Williams KL, Appel RD, Hochstrasser DF. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 1999;112:531-52. doi: 10.1385/1-59259-584-7:531. PMID: 10027275. 11. Saha S, Raghava GP. AlgPred: prediction of allergenic proteins and mapping of IgE epitopes. Nucleic Acids Res. 2006 Jul 1;34(Web Server issue):W202-9. doi: 10.1093/nar/gkl343. PMID: 16844994; PMCID: PMC1538830. 12. Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer EL. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. J Mol Biol. 2001 Jan 19;305(3):567-80. doi: 10.1006/jmbi.2000.4315. PMID: 11152613. 13. Yang J, Yan R, Roy A, Xu D, Poisson J, Zhang Y. The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction. Nat Methods. 2015 Jan;12(1):7-8. doi: 10.1038/nmeth.3213. PMID: 25549265; PMCID: PMC4428668. 14. Waterhouse A, Bertoni M, Bienert S, Studer G, Tauriello G, Gumienny R, Heer FT, de Beer TAP, Rempfer C, Bordoli L, Lepore R, Schwede T. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018 Jul 2;46(W1):W296-W303. doi: 10.1093/nar/gky427. PMID: 29788355; PMCID: PMC6030848. 15. Vita R, Mahajan S, Overton JA, Dhanda SK, Martini S, Cantrell JR, Wheeler DK, Sette A, Peters B. The Immune Epitope Database (IEDB): 2018 update. Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D339-D343. doi: 10.1093/nar/gky1006. PMID: 30357391; PMCID: PMC6324067. 16. Saha S, Raghava GP. Prediction of continuous B-cell epitopes in an antigen using recurrent neural network. Proteins. 2006 Oct 1;65(1):40-8. doi: 10.1002/prot.21078. PMID: 16894596. 17. Blom N, Sicheritz-Pontén T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S. Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence. Proteomics. 2004 Jun;4(6):1633-49. doi: 10.1002/pmic.200300771. PMID: 15174133. 18. Steentoft C, Vakhrushev SY, Joshi HJ, Kong Y, Vester-Christensen MB, Schjoldager KT, Lavrsen K, Dabelsteen S, Pedersen NB, Marcos-Silva L, Gupta R, Bennett EP, Mandel U, Brunak S, Wandall HH, Levery SB, Clausen H. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO J. 2013 May 15;32(10):1478-88. doi: 10.1038/emboj.2013.79. Epub 2013 Apr 12. PMID: 23584533; PMCID: PMC3655468. 19. Blom N, Gammeltoft S, Brunak S. Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites. J Mol Biol. 1999 Dec 17;294(5):1351-62. doi: 10.1006/jmbi.1999.3310. PMID: 10600390. 20. Ren J, Wen L, Gao X, Jin C, Xue Y, Yao X. CSS-Palm 2.0: an updated software for palmitoylation sites prediction. Protein Eng Des Sel. 2008 Nov;21(11):639-44. doi: 10.1093/protein/gzn039. Epub 2008 Aug 27. PMID: 18753194; PMCID: PMC2569006. 21. Klausen MS, Jespersen MC, Nielsen H, Jensen KK, Jurtz VI, Sønderby CK, Sommer MOA, Winther O, Nielsen M, Petersen B, Marcatili P. NetSurfP-2.0: Improved prediction of protein structural features by integrated deep learning. Proteins.2019 Jun;87(6):520-527. doi: 10.1002/prot.25674. Epub 2019 Mar 9. PMID:30785653.

Detay görüntüle