Terapötik bir enzim olan L-asparajinazın deniz kaynaklı filamentöz fungus suşlarından üretimi ve kısmi karakterizasyonu
Proje no. 22265 · Durum: Kapanmış · 2020
Özet
Çeşitli kanser hastalıklarında yüksek terapötik etkiye sahip olan L-asparajinaz, L-asparajini aspartat ve amonyağa hidroliz etmektedir. Sağlıklı hücreler L-asparajini sentezleyebilirken tümör hücreleri bu işlemi gerçekleştiremez dolayısıyla besin yetersizliği nedeniyle ölürler. Klinik uygulamalarda kullanılan L-asparajinaz başta anaflaksi olmak üzere çeşitli yan etkilere sahiptir. Ayrıca enzimin, glutaminaz ve üreaz aktivitelerinin olması yan etkilere neden olmaktadır. Glutaminaz, sağlıklı hücreler için gerekli olan glutamini parçalarken, üreaz ürenin hidrolizine dolayısıyla amonyak artışına neden olmaktadır. Bu projede, deniz kaynaklı fungusların glutaminaz ve üreaz negatif özellikte L-asparajinaz üretme potansiyellerinin değerlendirilmesi, aday üreticiye ait enzimin kısmi saflaştırma ve karakterizasyonu amaçlanmaktadır. Bu kapsamda, 94 adet deniz kaynaklı filamentöz fungus L-asparajinaz aktivitesinin belirlenmesi için hızlı plaka tarama yöntemiyle taranmıştır. L-asparajinaz üreticisi olduğu belirlenen 89 izolat glutaminaz ve üreaz aktivitesi için taranmış ve 4 aday üretici (Penicillum crustosum MF5, Aspergillus flavus MF10, Penicillum canescens MF20, Cladosporium cladosporioides MF75) seçilmiştir. Küçük ölçek fermantasyon çalışması ile en yüksek aktivite A. flavus MF10’dan elde edilmiştir. A. flavus MF10’un fermantasyon sıvısı ultrafiltrasyon ile konsantre edilmiş ardından aseton çöktürmesi gerçekleştirilmiştir. Kısmi saflaştırma ile 4,8 kat saflaştırılan enzimin molekül ağırlığının yaklaşık 100 kDa olduğu belirlenmiştir. Fermantasyon sıvısında üreaz ve glutaminaz aktiviteleri belirlenmezken konsantre edilen preparatta düşük glutaminaz aktivitesi (1,27 U/mL) belirlenmiş ancak üreaz aktivitesi tespit edilmemiştir. Kısmi karakterizasyon çalışmaları ile enzimin optimum sıcaklığı 40°C, optimum pH'ı ise 8 olarak belirlenmiştir. Enzimin bir saat sonunda 40°C’de aktivitesini %70 koruyabildiği, pH 7 ve 8’de aktivitesini koruduğu belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan L-asparajinazın 24 saat sonunda SH-SY5Y, LNCap hücrelerinin canlılığını azalttığı, L929 hücrelerinde sitotoksik etki göstermediği, HaCaT hücrelerinde düşük sitotoksisite gösterdiği belirlenmiştir.