Piyasadan Temin Edilen Hyssopi herba Droğu Üzerinde Kalite Kontrol ve Biyolojik Aktivite Çalışmaları

Proje no. 26315 · Durum: Kapanmış (Yayın bekleniyor) · 2023

Özet

Tıbbi ve aromatik bitkiler açısından zengin bir familya olan Lamiaceae familyasında bulunan Hyssopus officinalis Hazar denizinden Karadeniz’e kadar olan bölgede ve Asya kıtasında doğal yayılış göstermektedir. (Kulak, 2022).Bitki uyarıcı, gaz söktürücü ve midevi (Baytop, 1984) ayrıca solucan düşürücü, idrar söktürücü ve antibakteriyel özeliklere sahiptir (Güler,2007). Yapılan çalışmalarda Hyssopi herba’nın antikonvülsan etkisi (Yang ve ark., 2008), antienflamatuvar ve immün modülatör etki, antimikrobiyal, antibakteriyel, antifungal, antiviral (HIV virüsüne karşı etkili), antispazmodik, antidiyabetik, sitotoksik, antioksidan (Mićović et al., 2022), antitüberküloz, antihelmentik (HILAL et al.1978) etkileri olduğu belirtilmiştir. Halk arasında kullanımı bulunan zufa otuyla ilgili yeterli çalışma olmamakla birlikte başta Türk ve Avrupa Farmakopesi olmak üzere EMA, ESCOP, WHO ve FFD gibi çeşitli monograflar incelendiğinde bitki ile ilgili veriye rastlanamamıştır. Bu eksikliği gidermek amacıyla Avrupa Farmakopesi ve Türk Farmakopesi’nde yer alan kalite kontrol yöntemlerinden kurutmada kayıp, toplam kül, sülfat külü ve hidroklorik asitte çözünmeyen kül testleri yapılacaktır.  Vücutta gerçekleşen metabolizma olayları sonucunda veya çevresel etkenler (radyasyon, sigara kullanımı, çeşitli ilaçlar, çevre kirliliği) nedeni ile oksidatif hasar adı verilen duruma neden olan reaktif oksijen radikalleri oluşur. Reaktif oksijen radikalleri; enfeksiyon hastalıklarından kansere, metabolik hastalıklardan Alzheimer’a kadar çok çeşitli sağlık sorunlarının gelişiminde önemli etkisi olan bir grup toksik maddeyi ifade eder. Bu maddelerin zararlı etkilerinin önüne geçerek vücudu koruyan maddelere ise antioksidan adı verilir. (Yang ve ark., 2008 ) Yapılan çalışmalarda Hyssopi herba ekstrelerinde kersetin, apigenin, diosmin, klorojenik asit, rosmarinik asit ve sirinjik asit tespit edilmiştir (Mićović et al., 2022). Flavonoitler ve diğer fenolik bileşiklerin antioksidan etkisinden dolayı bitkiden hazırlanacak ekstreler üzerinde antioksidan aktivite çalışması, toplam fenolik madde, toplam flavonoit analizleri ve majör bileşenlerinden apigeninin HPLC-DAD ile miktar tayininin yapılması planlanmaktadır. Drog üzerinde yapılmış kısıtlı sayıda apigenin miktar tayini çalışmasına rastlanmıştır (Proestos, 2005). Yaşlılarda demans hastalığının en yaygın şekli olan Alzheimer hastalığı MSS’ de ve bilişsel işlevlerde bozukluklarla karakterize ölümle sonuçlanabilen bir hastalıktır. Yapılan çalışmalarda yapısal anormallikler ve nörotransmiter madde olan asetilkolinin azalması sonucu meydana geldiği tespit edilmiştir. (Kennedy and Scholey, 2022). Asetilkolinesteraz inhibisyonu ile asetilkolinin seviyesi arttırılır (Abdurqadir, 2016; Aynacı, Arslan, Sarı, & Yaşar, 2014; Diken, 2019) Dünyada ve Türkiye’de yaşlı nüfusun artmasıyla beraber Alzheimer hastalığı ve buna bağlı ölüm oranı artmaktadır. Kesin tedavisi olmamakla beraber mevcut tedavilerin yan etkileri bulunmaktadır. Bitkinin uçucu yağında ve yaprak ekstresinde asetilkolinesteraz inhibisyonuyla ilgili az sayıda çalışma (Perry N,1996) vardır, ancak herba örneğinde yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır. Ayrıca, Alzheimer hastalığının başlangıcını geciktirmede veya ilerlemesini yavaşlatmada etkili güçlü bir antioksidan olduğu belirtilen (Salehi et al.,2019) ve droğumuzda da majör bileşik olan apigeninin miktar tayini yapılması hedeflenmektedir Halk arasında kullanımı olan ancak Türk ve Avrupa Farmakopesi başta olmak üzere EMA, ESCOP, WHO ve FFD gibi çeşitli monograflarda yer almayan bu bitkiden hazırlanacak olan droglar üzerinde yapılması planlanan çeşitli kalite kontrol çalışmalarından elde edilecek veriler ileride bitkiden elde edilecek droglara ait monografların hazırlanmasında yararlanılabilir. Ayrıca bitki üzerinde kısıtlı sayıda antioksidan aktivite çalışması ve antikolinesteraz aktivite çalışmalarının bulunması nedeniyle literatüre katkıda bulunma potansiyeli bulunmaktadır Tez çalışması kapsamında piyasadan temin edilen Hyssopi herba droğu kullanılacaktır.Hyssopi herba droğu üzerinde kurutmada kayıp, toplam kül, sülfat külü ve hidroklorik asitte çözünmeyen kül testleri uygulanacaktır (Türk Farmakopesi).Ayrıca toz haline getirilmiş Hyssopi herba droğundan hazırlanacak metanol ekstreleri çalışma materyalini oluşturacaktır.Metanol Ekstresinin Hazırlanışı: Yaklaşık 10 g drog tartılıp, yaklaşık 100 ml metanolle ultrasonik banyoda 30 dk süreyle ekstraksiyon yapılacaktır. Süzüldükten sonra işlem 3 kez tekrarlanıp, süzüntüler birleştirilip, çözücü alçak basınç altında kuruluğa kadar distillenip, % verim hesaplanacaktır Gerektiğinde optimizasyon için modifikasyon yapılması söz konusu olabilir (Akyıldız Zİ 2019).Total Fenol Miktar Tayini: Tüm ekstrelerde toplam fenolik madde içeriği Folin-Ciocalteu yöntemine göre (McDonald, Prenzler, Antalovich, Robards, 2001) tayin edilecektir. Örneğin içerisinde bulunan fenolik bileşiklerin bazik ortamda Folin-Ciocalteu ayracını indirgeyip, kendilerinin yükseltgenmesine dayanan yöntemde indirgenen Folin ayracının oluşturduğu mavi rengin şiddeti fenolik maddelerin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Örnek çözeltisi ve %10 luk Folin Çözeltisi karıştırılıp, 30 dk sonra 1M Sodyum karbonat ilave edilip, bir saat süreyle karanlıkta bekletildikten sonra 760 nm dalga boyunda örneklerin absorbansları kör çözeltisine karşı okunacaktır. Örneklerin total fenolik madde içeriği farklı konsantrasyonlarda hazırlanacak olan gallik asit çözeltisi ile oluşturulan standart eğri denklemi üzerinden hesaplanacaktır.Toplam Flavonoit Miktar Tayini: Hazırlanacak olan drogların total flavonoit miktar tayini (Chang, Yang, Wen & Chern, 2002) spektrofotometrik yöntem kullanılarak gerçekleştirilecektir. Yöntem alüminyum klorürün asidik ortamda flavon ve flavonol yapılarının C-4 keto grubu ve C-3 veya C-5 hidroksil grupları ile kararlı kompleksler oluşturması esasına dayanmaktadır. Örnek çözeltisi, % 10 luk alüminyum klorür, 1 M potasyum asetat ile karıştırılıp, 30 dk süreyle bekletilip 415 nm dalga boyunda oluşan renkli kompleks 415 nm de maksimum absorbans vermektedir. Farklı konsantrasyonlarda hazırlanacak olan kersetin çözeltisi ile oluşturulan standart eğri denklemi üzerinden elde edilen absorbans değerlerine karşılık gelecek total flavonoit miktarları hesap edilecektirApigenin Miktar Tayini: Bitkide bulunan majör fenoliklerden olan rutin miktar tayini için ise HPLC-DAD yönteminden yararlanılacaktır (Brantner ve Males, 1999). Bitkinin farklı kısımlarından hazırlanan metanol ekstrelerinin rutin içeriği sabit faz olarak ters-faz kolon ve mobil faz olarak da su-fosforik asit-asetonitril gradient elüsyon sistemi kullanılarak analiz edilecektir. Analiz sırasında gerektiğinde yöntemin optimizasyonu için modifikasyonlar yapılması söz konusu olabilir. Ayrıca analitik yöntem validasyonu için doğrusallık, seçicilik, karar ve tayin limitleri, kesinlik, gerçeklik ve sağlamlık gibi parametreler incelenecektir. Apigenin analizi EGE-MATAL’dan hizmet alımı yapılarak gerçekleştirilecektir.Antikolinesteraz Aktivite Tayini: Asetilkolinesteraz ve butirilkolinesteraz enzim inhibisyonu için in vitro Ellman yöntemi (Bozkurt, Coban, Kaya, Onur, & Unver-Somer, 2017; Ellman, Courtney, Andres Jr, & Featherstone, 1961) esasına dayalı mikroplaka deneyi uygulanacaktır. Mikroplaka deneyinde enzimlerin (asetilkolinesteraz ve butirilkolinesteraz), substratlarla (asetiltiyokolin ve butiriltiyokolin) etkileşmesi sonucunda oluşan tiyokolin, Ellman reaktifi 5,5’-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile reaksiyona girmekte ve 2-nitrobenzoat-5-merkaptotiyokolin ve sarı renkli 5-tiyo-2-nitrobenzoat oluşturmaktadır. Ekstrelerin uygun konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlandıktan sonra reaksiyon sonucunda oluşan 5-tiyo-2-nitrobenzoat bileşiğine ait absorbanslar 405 nm dalga boyunda mikroplaka okuyucu cihazı kullanılarak ölçülecektir ve Graph-Pad Prism 5.0 programından yararlanılarak IC50 değerleri hesaplanacaktır.Ekstrelerin oksidatif hasara karşı etkinliği; hidrojen peroksitle indüklenmiş oksidatif stres modelinde hücre canlılığı açısından incelenecektir (Loubidi M. ve ark., 2018). Elde edilen sonuçların bilimsel kongrelerde bildiri ve makaleye dönüştürülmesi planlanmaktadır.Elde edilecek sonuçların ileride bitkiden hazırlanacak droglarla ilgili monografların hazırlanmasında kullanılma potansiyeli olabilir. KaynakçaAndry Gudzenko 2013The Pharma Innovation. Development and Validation of A Rp-Hplc Method for The Simultaneous Determination of Luteolin and Apigenin in Herb of Achillea Millefolium L. Available at: https://www.thepharmajournal.com/vol2Issue7/5.1.htmlAbdurqadir, A. H. (2016). Adiantumcapillus-veneris L.’ in Farklı Özütlerinin Alzheimer, Diabet ve Deri Hastalıklarıyla İlişkili Enzimleri İnhibe Etme Aktiviteleri ile Antioksidan Özellikleri. Aksaray Üniversitesi.Avrupa Farmakopesi 8.0, 2013. Aynacı, E., Arslan, F., Sarı, N., & Yaşar, A. (2014). Yeni Asetilkolinesteraz İnhibitörlerinin Sentezi, Karakterizasyonu ve İnhibisyon Özelliklerinin İncelenmesi. In2. İlaç Kimyası, Üretimi, Teknolojisi ve Standardizasyonu Kongresi. Brantner, A. H., &Males, Z. (1999). QualityAssessment of Paliurusspina-christiExtracts. Journal of Ethnopharmacology, 66, (s. 175–179). <a href="https://doi.org/10.1016/S0378-8741(98)00180-9" rel="noopener noreferrer" target="_blank">https://doi.org/10.1016/S0378-8741(98)00180-9</a>  Bozkurt, B., Coban, G., Kaya, G. I., Onur, M. A., &Unver-Somer, N. (2017). Alkaloid Profiling, Anticholinesterase Activity andMolecularModelingStudy of Galanthuselwesii. South AfricanJournal of Botany, 113, (s. 119–127). <a href="https://doi.org/10.1016/j.sajb.2017.08.004" rel="noopener noreferrer" target="_blank">https://doi.org/10.1016/j.sajb.2017.08.004</a> BAYTOP, T., 1984. Türkiye’de Bitkiler İle Tedavi (Geçmişten ve Bugüne). İstanbulÜniversitesi Yayınları No. 3225-Eczacılık Fakültesi No.40: 3-10 s.  Chang, CHIA-CHI, MING-HUA Yang, HWEI-MEI Wen, and JIING-CHUAN Chern. 2002. “Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods.” Journal of Food and Drug Analysis 10(3): 178–82 Diken, M. E. (2019). Farklı Bitki Özütlerinin Asetilkolinesteraz Aktivitesine Etkisinin Araştırılması. In13.Ulusal Afinite Teknikleri Kongresi (p. 36)., Ellman, G. L., Courtney, K. D., AndresJr, V., &Featherstone, R. M. (1961). A New and Rapid Colorimetric Determination of Acetylcholinesterase Activity. BiochemicalPharmacology, 7(2), (s. 88–95)Hılal J., Sayed H., El-Alfy, Taha S., El-Shereı, Moshera M., 1978. Investigation of the volatile oil of Hyssopus officinalis. Egypt Pharm. Sci., 19: 177–184. Hatipoğlu, G., 2022. Achilleabiserrata ve Hyssopusofficinalis türlerinin antioksidan aktiviteleri ve fenolik bileşen analizleri. [online] Acikerisim.ktu.edu.tr. Available at: <a href="http://acikerisim.ktu.edu.tr/jspui/handle/123456789/1621" rel="noopener noreferrer" target="_blank">http://acikerisim.ktu.edu.tr/jspui/handle/123456789/1621</a> Güler, V., Diyarbakır Koşullarında çördük OTU (hyssopus officinalis L.)'Nda Farklı Gelişme Dönemlerinde Verim ve Morfofenetik Varyabilitenin saptanması. CORE. Available at: <a href="https://core.ac.uk/display/286755930" rel="noopener noreferrer" target="_blank">https://core.ac.uk/display/286755930</a> Kulak, M., 2022. Recurrentdroughtstresseffects on essentialoil profile of Lamiaceaeplants: An approachregardingstressmemory.  Kennedy, D. andScholey, A., 2022. ThePsychopharmacology of EuropeanHerbswithCognition-EnhancingProperties     Loubidi M., JouhaJ.,Tber Z., Khouli M., Suzenet F., Akssira M., Erdogan MA, Kose FA, Dagcı T.,Arnagan G., Saso L., Guillaumet G. (2018). EfficientSynthesisand First Regioselective C-6 Direct Arylation of Imidazo[2,1-c][1,2,4]triazineScaffoldandtheir Evaluation in H2O2-induced OxidativeStress. Eur J MedChem, Feb 10;145, (s.113-123). Mićović, T., Topalović, D., Živković, L., Spremo-Potparević, B., Jakovljević, V., Matić, S., Popović, S., Baskić, D., Stešević, D., Samardžić, S., Stojanović, D. andMaksimović, Z., 2022. Antioxidant, AntigenotoxicandCytotoxic Activity of EssentialOilsandMethanolExtracts of Hyssopusofficinalis L. Subsp. aristatus (Godr.) Nyman (Lamiaceae McDonald, Suzy, Paul D Prenzler, Michael Antolovich, and Kevin Robards. 2001. “Phenolic Content and Antioxidant Activity of Olive Extracts.” Food Chemistry 73(1): 73–84. Perry, N., court, G., bidet, N., court, J. and perry, E. (1996) European herbs with cholinergic activities potential in dementia therapy. International Journal of Geriatric Psychiatry, 11, 1063-1069. - references - scientificresearchpublishing.Availableat: https://www.scirp.org/%28S%28vtj3fa45qm1ean45vvffcz55%29%29/reference/referencespapers.aspx?referenceid=1233172 Proestos C, Chorianopoulos N, Nychas G-J Komaitis EM (2005). RPHPLC analysis of the phenolic compounds of plant extracts. Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity. J. Agric. Food Chem., 53: 1190-1195 SalehiB;VendittiA;Sharifi-RadM;KręgielD;Sharifi RadJ;DurazzoA;LucariniM;SantiniA;SoutoEB;NovellinoE;AntolakH;AzziniE;SetzerWN;Martins N;       Thetherapeuticpotential of apigenin. International journal of molecularsciences. Available at: <a href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30875872/" rel="noopener noreferrer" target="_blank">https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30875872/</a>  Sharifi-Rad, J., Quispe, C., Kumar, M., Akram, M., Amin, M., Iqbal, M., Koirala, N., Sytar, O., Kregiel, D., Nicola, S., Ertani, A., Victoriano, M., Khosravi-Dehaghi, N., Martorell, M., Alshehri, M., Butnariu, M., Pentea, M., Rotariu, L., Calina, D., Cruz-Martins, N. andCho, W., 2022. HyssopusEssentialOil: An Update of ItsPhytochemistry, BiologicalActivities, andSafety Profile Tubives.com. Available at: <a href="http://www.tubives.com/" rel="noopener noreferrer" target="_blank">http://www.tubives.com</a>   Wang N, Yang X-W (2010). Two new flavonoid glycosidesfromthewholeherbs of Hyssopusofficinalis. J. Asian Natural. Prod. Res., 12: 1044-1050 Yang, J., Guo, J., &amp; Yuan, J. (2022). In vitro antioxidantproperties of rutin. Retrieved 26May 2022, from(2022). Retrieved 26 May 2022, from<a href="https://academicjournals.org/article/article1387885201_Rop%20et%20al.pdf" rel="noopener noreferrer" target="_blank">https://academicjournals.org/article/article1387885201_Rop%20et%20al.pdf</a> Z.X.H.-Y.G.T.-H.X.T., Physicochemicalevaluationandessentialoilcompositionanalysis of    HyssopusCuspidatusBorissfromXinjiang, China. Pharmacognosy magazine. Available at: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21120028/

Detay görüntüle