Korneal Epitel Yara İyileşmesinde İnsan Göbek Kordonu Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların Etkinliğinin Otolog Serum Uygulaması İle Karşılaştırmalı Değerlendirilmesi

Proje no. 30827 · Durum: Kapanmış (Yayın bekleniyor) · 2024

Özet

Oftalmolojide, re-epitelizasyonu kolaylaştıracak tedavi ihtiyacı halihazırda önemini korumaktadır. Bu amaçla iyileşmeyi hızlandırmak için epitel rejenerasyon süreçlerinde anahtar rol oynayan büyüme faktörleri ve sitokinleri içeren otolog serum ve göbek kordonu serumu gibi ileri tedavi uygulamaları kullanılmaktadır. Eksozomlar, hastalık ilişkili hücre ve mekanizmaları seçici olarak hedeflemek amacıyla terapötik molekülleri taşıyıcı veziküller olarak kullanılmalarının yanı sıra, mezenkimal kök hücre kaynaklı eksozomların özellikle immünoregülasyona katkıda bulunduğu bilinen çeşitli sitokinler ve büyüme faktörlerini de (örn. IL-6, IL-10, HGF, TGFβ1) içerdiği gösterilmiştir. Oküler hastalıklarda, MKH kaynaklı eksozomların, inflamasyonu ve hasarı önlemede nakledilen MKH'ler kadar etkili olacağı görüşünün yanı sıra, MKH'den türetilen eksozomların kornea epiteli üzerindeki terapötik yeteneklerini ve in vivo etki mekanizmalarını aydınlatmak için literatürde çok fazla çalışma bulunmamaktadır. Varolan kısıtlı sayıdaki çalışmada ise fare modeli kullanılmıştır ve bu modellerde kullanılan eksozom tedavisi korneal skarlaşmayı, inflamasyonu ve fibrozisi azaltırken, korneal epitelyal rejenerasyonu desteklediği gösterilmiştir. Öte yandan tavşanın özellikle oküler yüzey çalışmaları için fare ve sıçanlara göre kullanımları daha avantajlıdır. Bunun nedenini, globun daha büyük olması, oküler yüzeye ait testlerin daha güvenle uygulanabilmesi ve ilaç çalışmaları için sahip oldukları oküler yüzey biyokimyasal özelliklerinin daha uygun olması oluşturmaktadır.Bu proje ile amacımız tıbbın diğer alanlarında klinik uygulamada yerini almaya başlayan mezenkimal kök hücre kaynaklı eksozom tedavisinin deneysel kornea yara modelinde etkinliğini göstermek ve preklinik araştırmasını tamamlamaktır. Bu sayede ürünleşme yolunda klinik araştırmaya yönelik alt yapısı tamamlanmış olacaktır. Bu çalışmada ilk olarak Whatron Jelly kaynaklı MKH kökenli eksozomlar, yasal faaliyet izni doğrultusunda hazırlanacaktır. Çalışma dahilinde, Ege Üniversitesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı’nda elektif sezeryan ile term doğum yapmış 4 farklı gebeye ait kordon toplanacaktır. Daha sonra kordon örnekleri, steril bir kabın içerisine bir miktar soğuk fosfat buffer saline (PBS) ile birlikte yıkanarak üzerlerindeki pıhtı kalıntıları ve kan tamamen temizlenecektir. Tüm kordon önce boyuna kesilecek ve kordon içerisindeki iki arter ve bir ven disekte edilip Wharton jeli bölgesi ortaya çıkarılacaktır. Daha sonra aşağıda detayları verilen eksplant kültür yöntemi ile MKH izolasyonu yapılacaktır. Parçalama işlemi yapıldıktan sonra 300 cm2’lik flasklar içerisine, doku parçalarının Wharton Jelly içeren tarafları zemine bakacak şekilde yerleştirilecektir. Doku parçaları arasında yaklaşık olarak 2 cm alanlar bırakılacaktır. Bu işlemden sonra flasklar 37°C sıcaklıktaki inkübatörlerde inkübe edilecek ve doku parçalarının flask yüzeyine yapışması sağlanacaktır. Flasklar %80-90 konfluense ulaştıktan sonra flask içerisindeki eksozomca zengin olan besiyerleri (Condition media) eksozom izolasyonu için toplanacaktır. İlgili eksozomları sentezleyen hücreler de tripsinizasyon ile kaldırılarak karakterizasyon analizleri için numune haline getirilecektir. İzole edilen MHK'lerin karakteristik analizi için flow sitometrik ticari antikorlar kullanılacaktır. Kit protokolüne göre hücreler kit prosedürlerine göre dört farklı (CD44, CD73, CD90 ve CD105) antijen antikorları ile etiketlenecektir. Negatif antikor grubu olarak da mezenkimal kök hücrelerde sentezlenmemesi gereken antijenler olan CD34, CD45, CD11b, CD19, CD14, CD79a ve HLA-DR kullanılacaktır. MHK'lerde eksozom izolasyonu için toplanan Condition Medium (CM) 300 g’de, +4°C’de 10 dakika boyunca santrifüj yapıldıktan sonra pellet uzaklaştırılıp yeniden 2.000 g’de +4°C’de 20 dakika santrifüj yapılacaktır. Bu işlemden sonra ultrasantrifüj işlemlerine geçilecektir. Condition media ultrasantrifüj tüplerine aktarılarak 10.000 g’de +4°C’de 30 dakika santrifüj edilecektir. Santrifüj işleminden sonra supernatant toplanacak ve 70 dakika boyunca 100.000 g’de +4°C’de ultrasantrifüj yapılacaktır. Ultrasantrifüj işleminden sonra izole edilen eksozomlar izotonik sodium klorür yardımı ile süspanse edilecektir. Süspanse edilen eksozomlar, herhangi büyük partiküllere karşı 0,22 µm por çaplı filtrelerden geçirilecektir.  Pierce BCA Protein Assay Kit kullanılarak üreticinin talimatları doğrultusunda protein konsantrasyonu tayin edilecektir. Öncelikle standart grafiği oluşturulmak üzere serum albümin proteinleri farklı konsantrasyonlarda (0 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1500 µg/ml, 2000 µg/ml) hazırlanarak 96 kuyulu mikroplakalara 25 µl hacimde pipetlenecektir. Ardından, eksozom örneklerinden de 25 µl hacimde 96 kuyulu mikroplakaların diğer kuyularına pipetlenecektir. Kit üreticisinin talimatları doğrultusunda hazırlanan BCA çalışma reaktifinden standart ve örneklerin bulunduğu kuyulara 200 µl hacimde pipetlenecektir. Hazırlanan mikroplaka 37°C'de 30 dakika inkübe edilerek reaksiyonun gerçekleşmesi sağlanacaktır. Protein bulunan örneklerin bulunduğu kuyularda mor – koyu mor renk değişimleri meydana gelecektir. Bu değişimin sayısal veri olarak elde edilmesi için spektorfotometrik ölçüm yapılacaktır.  Hayvan deneyi modelinde tavşanların gruplandırılmasında kontrol grubu dahil 3 deney grubu yer alacaktır. Kontrol grubunda 4, diğer gruplarda ise 6’şar olmak üzere çalışmaya toplam 16 adet Yeni Zelanda tavşanı dahil edilecektir. Tüm tavşanlara sedasyon için 35-50 mg/kg ketamin ve 5-10 mg/kg ksilazin intramüsküler (İM) veya subkutan (SC) olarak verilecektir. Topikal anestezi (proparakain hidroklorid) sonrası steril koşular altında tüm gruplardaki hayvanların sağ gözlerine %5’lik povidon iyodin damlatılmasının ardından santral 6,5 mm çapındaki dairesel alanda bulunan kornea epiteli mekanik olarak tümüyle debride edilerek deneysel korneal yara modeli oluşturulacaktır. Tavşanların sağ gözüne Grup 1’de 1 × 106/μl konsantrasyonda eksozom, Grup 2’de otolog serum, Grup 3’te ise suni göz yaşı tedavisi uygulanacaktır. Tüm damlalar günde 4 doz (6 saat arayla 1’er damla) olacak şekilde uygulanacaktır. Tüm gruplardaki debridman yapılan gözlere sekonder enfeksiyonları önlemek amacıyla prezervansız antibiyotik damlası günde 4 kez damlatılacaktır. Altı gün süresince, her gün tüm grupların kornealarının klinik görünümü fotoğraflanacak, korneal re-epitelizasyonun süresi, korneal re-epitelizasyon alanı ve korneal opasite miktarı değerlendirilecektir. Kemozis, konjonktival hiperemi, kapak ödemi bulguları değerlendirilecek ve 0 ile 3 arasında skorlanacaktır (0=bulgu yok, 1= hafif bulgu, 2= orta bulgu, 3= ağır bulgu varlığı). Toplamda 7 günlük izlem süresi sonunda tavşanlar intravenöz yüksek doz anestezik uygulaması ile sakrifiye edilecektir. Gözler glob bütünlüğü korunarak enüklee edildikten sonra %10’luk formaldehite konularak, ışık mikroskobisinde incelenmek üzere transfer edilecektir. Fiksasyon sonrası parafine gömülen ve kesit alınan örnekler hematoksilen eosin boyası ile boyanacaktır. Işık mikroskobisi altında kornea yüzeyi, yara iyileşmesi açısından semi kantitatif olarak incelenecektir. Ödem, mono nükleer inflamatuvar hücre infiltrasyonu, fibroplazi, neovaskülarizasyon ve reaktif rejeneratif değişiklikler değerlendirilecek ve skorlanacaktır. Kesitlerin dijital fotoğrafları alınarak kaydedilecektir. Elde edilen dataların normalite ve homojenite analizleri yapılarak uygun istatistiksel yöntem belirlenip SPSS programı (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ile analiz edilecektir. p<0.05 olduğunda değişimler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilecektir.

Detay görüntüle