HIV POZİTİF HASTALARDA PROTEAZ, REVERSTRANSKRİPTAZ VE İNTEGRAZ İNHİBİTÖRLERİNEKARŞI GELİŞEN İLAÇ DİRENÇLERİNİN YENİ NESİLDİZİLEME (YND-NGS) İLE ARAŞTIRILMASI
Proje no. 88 · Durum: Kapanmış · 2017
Özet
AMAÇ: Human Immunodeficiency Virus (HIV) infeksiyonu, antiretroviral ilaçların uygun kombinasyonlarda (highly active antiretroviral therapy-HAART) kullanılmasıyla ölümcül bir hastalıktan kontrol altına alınabilen kronik bir hastalığa dönüşmüştür. Uzun ve etkili HIV enfeksiyonu tedavisinin önündeki en büyük engellerden biri antiretroviral ilaç direncidir. En uygun tedavi rejiminin belirlenmesi için tanıdan sonra mümkün olan en kısa zamanda ilaç duyarlılık testinin yapılması önerilir. Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu HIV ilaç direnç mutasyonlarının saptanmasında altın standarttır. Ama %20’nın altında bulunan direnç mutasyonlarını saptayamaması dezavantajıdır. Ayrıca Sanger temelli ticari kitler esas olarak proteaz ve revers transkriptaz gen bölge mutasyonlarını tespit etmektedir. Yeni nesil dizileme (YND) ile >%1 mutasyonların saptanması mümkün hale gelmiştir. İntegraz inhibitörlerinin ilk tedavi seçeneği olarak artan kullanımı ile bu ilaçlara karşı gelişen direnç mutasyonlarının da izlenmesi gerekliliği gündeme gelmiştir. Çalışmamızda YND ile proteaz, revers transkriptaz ile birlikte integraz bölge direnç mutasyonlarını tek bir amplikon kullanılarak saptanması amaçlanmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM: Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Moleküler Viroloji Laboratuvarı’nda HIV pozitif hasta örneklerinden 2008 yılı itibariyle Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu temelli Viroseq (Abbott, ABD) ile proteaz, revers transkriptaz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençleri rutin olarak çalışılmaktadır. Çalışmamıza arşivlenmiş olan örneklerden farklı direnç profiline sahip 40 HIV pozitif hasta örneği dahil edilmiştir. HIV pol gen bölgesinin dizilenmesi ve subtiplerin belirlenmesi için hasta örneklerinden viral RNA ekstraksiyonu, tek basamak RT (Reverse-Transcription) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve nested PCR sonrası elde edilen ürünler YND teknolojisi ile dizilendi. Sekans verileri, HXB2 referans sekansı (GenBank accession # NC_001802) CLC Genomics Workbench versiyon 8.1 ile %1 ve %5 cut off kullanılarak analiz edildi. Mutasyon belirlenmesi ve subtiplendirme Stanford Üniversitesi HIV-1 ilaç Direnci Veri Bankası versiyon 8.4 (http://hivdb.stanford.edu) kullanılarak yapıldı. BULGULAR: 40 hastanın 27’si alttip B (%67,5), altısı B+CRF 02_AG (%15), üçü alttip A (%7,5), ikisi G+J (%5), biri CRF07_BC (%2,5) ve biri B+F (%2,5) şeklinde saptanmıştır. Örneklerin yedisinde (%17,5) en az bir antiretroviral ilaca olası düşük seviyeden yüksek seviyeye kadar değişen direnç tespit edilmiştir; nükleotid revers transkriptaz inhibitörleri (NRTI) ve non-nükleozid revers transkriptaz inhibitörleri (NNRTI) direnç mutasyonları oranı sırasıyla %5, %12,5 olarak bulunmuştur. Proteaz inhibitörü (PI) ve integraz inhibitörü (INSTI) direnç mutasyonu ise saptanmamıştır. Bir örnekte K103N majör NNRTI mutasyonu, iki örnekte M41L ve T215D/S mutasyonu, iki örnekte E138A mutasyonu, iki örnekte E138G mutasyonu tespitedilmiştir. Proteaz ve revers transkriptaz inhibitörlerine karşı gelişen direnç ve genotip açıdan 40 örneğin sonuçları Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile uyumlu (%100) bulunmuştur. %1 ve %5 cut off arasında fark saptanmamıştır. SONUÇ: Çalışmamızda 40 hasta örneğinin YND ile PI, NRTI, NNRTI İle birlikte INSTI’ne karşı gelişen ilaç dirençleri tek bir amplikon kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yöntemle hem integraz gen bölgesi dizi analizi yapılmış hem de örneklerin havuzlanması ve “multiplekslenmesi” (tek seferde birçok testin birlikte çalışılması) ile ?%90 oranında maliyet düşmüştür. Ayrıca >%1 ilaç dirençli mutasyonların tespit edilmesi hastaların tedavisininin yönlendirilmesinde yol gösterici olacaktır. Anahtar Kelimeler: HIV İlaç Direnci, Yeni Nesil Dizileme, İntegraz gen bölge dizi analizi