PONATİNİB VE VS-5584 TERAPÖTİK AJANLARDA KRONİK MİYELOİD LÖSEMİ LÖKOMOGENEZİNE ETKİLERİ
Proje no. 3 · Durum: Kapanmış · 2015
Özet
Kronik miyeloid lösemi (KML), sürekli tirozin kinaz aktivitesi sergileyen BCR-ABL1 füzyon proteinine sahip hücrelerle karakterize miyeloproliferatif bir hastalıktır. Bu nedenle hastalığın tedavisinde tirozin kinaz inhibitörleri kullanılmaktadır. Ponatinib, T315I dahil olmak üzere birçok BCR-ABL1 otofosforilasyonunu inhibe edebilen ATP-yarışmalı tirozin kinaz inhibitörüdür. Lösemi kök hücreleri, normal hematopoietik kök hücrelerle benzer özelliklere sahip malignant hücrelerdir. Tirozin kinaz inhibitörleri, primitif lösemi kök hücreleri üzerinde etkili olmadıkları için tedavinin etkinliği düşük olabilmektedir. Ayrıca, ciddi yan etkilerin önlenmesi için kullanılan düşük tirozin kinaz inhibitörü dozları, KML hücrelerinde aktif halde bulunan alternatif sağkalım yolaklarının baskılanmasını sağlayamamaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü tedavisinin başarısının düşük olduğu KML olgularında ponatinibin tek ilaç olarak kullanımından ziyade çoklu hedefli tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine ihtiyaç olduğu açıktır. KML’de aktif olduğu bilinen PI3K/Akt/mTOR yolağının inhibitörlerinden VS-5584, tercihen kanser kök hücrelerini öldüren, potent, seçici bir dual inhibitördür. Bu tez çalışmasında KML tedavisindeki eksikliklerin üstesinden gelebilecek in vitro kombinasyon terapisinin belirlenebilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla VS-5584 ile ponatinibin kombinasyonlarıyla BCR-ABL1 ve PI3K/Akt/mTOR yolaklarının eş zamanlı inhibe edilmesinin KML ve lösemi kök hücrelerinin eliminasyonundaki etkisi ve rolü moleküler düzeyde araştırılmıştır. KML hücre modeli K562, lösemi kök hücre modeli LSC ve normal hematopoietik kök hücre modeli HSC hücre hatlarında, VS-5584’ün, ponatinibin ve kombinasyonlarının sitotoksik etkileri WST-8 testi ile belirlendi. Kombinasyon indeksleri CalcuSyn izobologram analiziyle değerlendirildi. Belirlenen IC50, IC75, ED50 ve ED75 dozlarının apoptotik etkileri Anneksin V ve aktif kaspaz-3 analizleri ile hücre döngüsüne etkileri PI analizi ile akım sitometride ve siklin D1, p27 antikorlarıyla western blotma ile değerlendirildi. PI3K/Akt/mTOR yolağındaki proteinlerin aktivitelerindeki değişimler, antikor array ile fosforile protein seviyelerinin kantitasyonu yapılarak, ölçüldü. Transkripsiyon faktörlerinin aktivelerindeki değişimler uygun vektörlerin transfeksiyonu sonrasında dual lusiferaz aktivitesi ile kantite edildi. Aktivitesi değişen transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin mRNA seviyelerindeki değişimleri saptamak için qRT-PCR gerçekleştirildi.