Bromodomain İnhibitörü PLX51107 ile HDAC İnhibitörü SAHA Epigenetik Ajanların AML Hücre Dizisi Üzerindeki Terapotik Etkilerinin Araştırılması
Proje no. 20763 · Durum: Kapanmış · 2019
Özet
Proliferasyon hızı normal hücrelere göre artmış ve spontan apoptozu azalmış hücrelerin klonal proliferasyonu ile seyreden ve prolife olmuş hücrelerin kemik iliği işgali ile devam eden malin bir hastalık grubu olarak karşımıza çıkan akut myeloid lösemi, diğer lösemi türlerinin %20’sini oluşturmaktadır. Kanser başlangıcı ve gelişimi süreci, hücrelerin transkripsiyonel ifadelenmesini epigenetik ve genomik değişiklikler sayesinde düzenlemektedir. Nükleozomal histon proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonları kanser hücrelerinde ve normal hücrelerde gen ekspresyonun ve kromatin organizasyonunu düzenlemekte olup, bunlar arasında, N-terminal histon kuyruklarının asetilasyonu ökromatinin ve aktif gen transkripsiyonunun temel epigenetik işaretini temsil etmektedir. Kanser tedavisi için epigenetik “reader’ları” yani bromodomainleri hedefleyen klinik çalışmalar, akut myeloid lösemi ve diğer kanser tedavilerinde ekstraterminal (BET) inhibitörleri ve bromodomain (BRD) etkinliğini gösermiştir.Bromodomain ve extra-terminal (BET) proteinleri, asetillenmiş lizin kuyruklarını tanımak için tandem bromodomainleri (BRD) modülleri kullanan epigenetik okuyucular olarak karşımıza çıkmaktadır. Transkripsiyonda ve malignitede BET proteinlerinin kritik rolü göz önüne alındığında BET ailesi proteinlerine inhibitörler geliştirmek için önemli çabalar gösterilmiştir. 2000’li yılların sonunda, BRD’ler ve asetil-lizin arasındaki hidrofobik etkileşimin karakterize edilmesinden sonra, BET proteinlerinin ve asetil- lizinin BRD’si arasındaki etkileşimi bozan triazolothienodiazepin bileşikleri sentezlenmiştir. Bu tez kapsamında, yeni keşfedilen yapısal olarak farklı, BRD4 proteininin bromodomainlerinde asetillenmiş lizin tanıma motiflerine bağlanarak BRD4'ün histonlar üzerindeki asetillenmiş lizinlere bağlanmasını engelleyen PLX51107 inhibitörü kullanılarak ve HDAC inhibitörü SAHA(vorinostat)’nın tek başına/kombine uygulamaları sonrasında; lösemik hücreler üzerindeki apoptotik, sitotoksik etkilerin değerlendirilmesi, karsinogenetik süreçte önemli seçilmiş genlerin mRNA seviyesindeki ekspresyon değişimlerinin tespiti gibi hücresel yanıtların belirlenmesi amaçlanmıştır. Uygun koşullar altında HL60 ve lösemi olmayan kontrol grubu çoğaltılarak XTT reaktifi ile proliferasyonu ve sitotoksisite analizleri gerçekleştirilerek, Plx51107 ve vorinostat için IC50 dozu belirlenmiştir. Belirlenen IC50 dozuna göre etken maddelerin hücreler üzeindeki apoptotik etkisi ve seçilmiş hedef genlerin ekspresyon seviyeleri RT-PCR ile değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler ışığında Plx51107 ve Vorinostat’tın HL60 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi saptanmış olup IC50 değeri; Plx51107 için 72.saatte 6,68uM; Vorinostat için 48.saatte 4,3uM olarak hesaplanmıştır. Lösemi olmayan kontrol grubu hücre hattı için(NCIBL2171) ise Plx51107 için 72.saatte 1,24um; Vorinostat için 48.saatte 2,01um olarak hesaplanmıştır. İki etken maddenin kombine uygulaması ile sitotoksisite değerlendirildiğinde NCIBL2171 hücre hattı için dozlar arasında antogonistik bir etki saptandığı için lösemi olmayan kontrol grubunda iki etken maddenin kombinasyonu değerlendirilmeye alınmamıştır. HL60 hücre hattı için kombinasyon analizi değerlendirildiğinde, sinerjistik etkinin, vorinostat IC50 dozu sabit tutularak plx51107 IC50 dozu ve 1,5 katının değerinde olduğu saptanmıştır. Tespit edilen IC50 dozlarına göre etken maddelerin hücreler üzerindeki apoptotik etkileri Annexin V analizi ile değerlendirilmiştir. Sonuçlara göre etken maddelerin hücreler üzerindeki apoptotik etkileri yaklaşık %80-%97.4 aralığında saptanmıştır. Seçilmiş hedef genlere ilişkin RT-PCR analiz sonuçlarına göre apoptotik genlerden Bcl-2, Casp3 genlerinde sırasıyla 1,23 ve 15,8 kat azalış olduğu gözlenmiştir. Hücre döngüsü genlerinden olan CDKN2A için de Plx51107 IC50 dozunun 1,5 katında 4,85 kat; combo1 için ise 3,97 kat azalış olduğu belirlenmiştir. Genlere ait ekspresyonel değişimler göz önüne alınarak seçilen hedef BRD4 proteinin hücreler üzerindeki ekspresyon değişimi incelenerek western blot analizi gerçekleştirilmiştir. Analiz sonuçlarına göre ekspresyon değişimindeki azalma western blot analizi sonucu ile de doğrulanmaktadır. Son olarak hücre döngüsü analizi ile ajanların hangi hücre döngüsü aşamasında( G1/S/G2)arreste neden olduğu incelenmiştir. Sonuç olarak bromodomain inhibitörü olan Plx51107, HL60 hücre hattında sitotoksik etki göstererek apoptotik etkiye neden olmuştur ve seçilmiş hedef genlerin ekspresyon düzeylerindeki azalma beklendiği gibi olmuştur. Bu nedenle, Plx51107’nin, diğer hematolojik maliniteler için de önemli bir tedavi yaklaşımı olabileceği ve klinik denemeye hızlı bir şekilde geçmesini destekleyebileceği düşünülmektedir.