Amniyon Membran Ekstrakt Eldesinde Verimliliğin Artırılması ve Liyofilizasyonu Sürecinde Stabilizasyonun Sağlanması
Proje no. 24091 · Durum: Kapanmış (Yayın bekleniyor) · 2022
Özet
<p>İnsan amniyon membranı (iAM); plasentanın epitel, bazal membran ve bağ dokusundan oluşan iç tabakası olup; sitokinler, büyüme faktörleri, kollajen ve laminin içeriğinden zengin bir ekstrasellüler matrikse sahiptir. Bu özellikleriyle epitel hücrelerinin proliferasyonunu kolaylaştırmanın yanında; inflamasyon, skarlaşma ve anjiogenezi baskılayarak prevelansı ve insidansı yüksek, dirençli patolojilerde iyileşme sağlayabilmektedir. Tıpta birçok alanda ve özellikle oftalmolojide yaygın kullanımı bulunmaktadır. Oftalmoloji kliniğinde, özellikle ağır kimyasal yanıkların tedavisinde, dirençli epitel defektlerinde, re-epitelizasyonu sağlamak, inflamasyonu ve enfeksiyonu kontrol etmek, yer kaplayıcı özelliğinden faydalanmak amacıyla uygulanan iAM, sıklıkla kriyoprezervasyonla hazırlandıktan sonra “amniyon membran transplantasyonu (AMT)” şeklinde kullanılmaktadır. Transplantasyon sonrası, gözde ortalama 2-8 hafta arası kaldıktan sonra degrade olmaktadır. Bu kullanım şeklinin, cerrahi gerektirmesi, istenilen süre kadar kullanılamaması ve yarı opak yapısı nedeniyle objektif klinik gözlemin yapılamaması gibi kısıtlılıkları bulunmaktadır. Bu kısıtlılıkları azaltmak adına, amniyon membran ekstraktının (AME) hazırlanması, uygun saklama koşullarının sağlanması amacıyla liyofilize edilmesi ve buradan hareketle oftalmik çözeltisinin hazırlanarak klinik pratikte uygulanması fikri doğmuştur. AME eldesi ve saklanması ile ilgili günümüzde dünyada halen birçok aktif çalışma sürdürülmektedir. iAM ekstraksiyonu, tanım olarak amniyon membranın belli işlemlerden geçerek özünün elde edilmesi anlamı taşımaktadır. Topikal veya enjeksiyon formunda tıbbın farklı dallarında kullanım alanına sahiptir. AME formu kullanımının en büyük avantajı, cerrahi girişim gerektirmemesi, tedavi süresince oküler yüzeyin objektif klinik gözleminin yapılabilmesi, uygulama süresi boyunca yüksek ve sabit miktarda büyüme faktörü desteği sağlayabilmesi ve uzun bir raf ömrüne sahip olabilme potansiyelidir. Araştırma grubumuz, Ege Üniversitesi bünyesinde, 2020 Haziran ayı itibariyle çok disiplinli öncelikli alan projesi kapsamında ulusal platformda AME ürünü geliştirmek üzere geniş çapta bir araştırma başlatmıştır. Eylül 2022 tarihinde kapanışını yapacağımız bu projemizde, AME eldesini sağlayarak AME’nin protein ve büyüme faktörlerinin analizini gerçekleştirmiş bulunuyoruz. AME liyofilizasyon işlemini ve sterilizasyonunu tamamladık. Yine bu süreçte, AME’yi ürüne dönüştürme yolunda biri tamamlanmış iki adet <em>in vitro</em> TÜBİTAK-TEYDEB (1512 ve 1507) çalışması yürütmüş olup ayrıca yara iyileşmesi ve kimyasal yara deneysel hayvan modellerinde yürütmekte olduğumuz 1’i üniversite destekli BAP, 1’i ise TÜSEB destekli iki projemiz bulunmaktadır.</p><p>Literatürde AME hazırlığı için birçok farklı yöntem kullanılmış olsa da bu yöntemlerin birbirine üstünlüğü halen açıklığa kavuşmamıştır. Taze amniyon membranının protein konsantrasyonunun yaklaşık 3 mg/ml seviyesinde olduğu bilinmektedir. Çeşitli çalışmalarda, homojenizasyon, sonikasyon ve pulverizasyon yöntemleri kullanılarak elde edilen AME’nin 1,5 mg/ml seviyesinde total protein konsantrasyonuna sahip olduğu raporlanmaktadır. Biz de öncelikli alan projesi kapsamında geliştirdiğimiz yöntemler bütünü doğrultusunda elde ettiğimiz AME’nin total protein konsantrasyonunu 1,4 -1,6 mg/ml düzeyinde standardize etmeyi başarmış bulunmaktayız. Yine elde ettiğimiz AME’nin total protein başına büyüme faktörleri (EGF, FGF, HGF, KGF, NGF ve TGF- β) içeriğinin de literatür ile uyumlu olduğunu gösterdik. Tüm bunlara ilaveten çalışmamız boyunca bazı aşamalardaki kritik müdahalelerin AME içeriğini protein düzeyini zenginleştirmede katkısı olduğunu gösteren ön çalışma sonuçları elde ettik. Bu ön çalışmalar doğrultusunda AME eldesinde verimliliğin artırılabileceğini gösterdik. Halen tedarik zorluğu ve maliyet gibi dezavantajları bulunan AME tıbbi ürününün hazırlık aşamasında verimliliğinin (total protein içeriği) artırılması bu dezavantajları minimuma çekmek ve ürünleşme yolunda ilerlemek adına büyük önem taşımaktadır. Ayrıca AME eldesinin daha verimli hale getirilmesinin ve verimli ürünün de stabilitesinin sağlanmasının, klinik sonuçların iyileştirilmesine öncülük etmesi kuvvetle muhtemeldir. Bu amaçla planladığımız yeni çok disiplinli araştırma projesinde, önceki projelerde geliştirdiğimiz ekstraksiyon yöntemine, ön çalışmalarda etkisini gösterdiğimiz üç ana aşama olan, proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin kullanımı, filtreleme ve liyofilizasyon sürecinde stabilizatör olarak trehaloz kullanımının yanı sıra farklı kompozisyonlara sahip ekstraksiyon tamponlarının AME içeriğine etkisini kantitatif olarak göstermeyi, böylece ürün eldesinde ekstraksiyon verimliliğini ve protein stabilitesini artırmayı hedeflemekteyiz. Bu aşamaların etkisinin tanımlanması ile literatürdeki örneklerinden farklı özgün bir ürün haline gelmesini planladığımız bu biyolojik tıbbi ürün için ulusal ve uluslararası patent başvurusu yapmayı planlamaktayız.</p><p><strong>Anahtar Kelimeler: </strong>Amniyon membran, amniyon membran ekstraktı, amniyon membran ekstraktı göz damlası, verimlilik, stabilizasyon, liyofilizasyon</p>