Kuzu ayaklarından bazı ekstrasellüler matriks bileşenlerinin (kolajen ve GAG) ultrason destekli ekstraksiyonu ve karakterizasyonu
Proje no. 1402 · Durum: Kapanmış · 2017
Özet
Bu tez çalışmasında, ekstrasellüler matriks bileşenlerinden kolajen ve glukozaminoglikanların (GAG) ultrason destekli esktraksiyonu ve saflaştırılması hedeflenmiştir. Çalışma kapsamında, kuzu ayakları, hammadde kaynağı olarak kullanılmış ve en yüksek düzeyde verim eldesi için uygun ekstraksiyon koşulları belirlenmiştir. Farklı sıc aklık ve sürelerde uygulanan ultrason işleminin kolajen ve GAG yapısı üzerine etkileri incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, kolajen eldesi için uygun ekstraksiyon parametreleri belirlenmiştir. Ekstraksiyon işleminde enzimatik hidroliz yöntemi seçilmiş ve pepsin enzimi kullanılmıştır. Ön işlemleri tamamlanan kuzu ayakları, ekstraksiyon işlemi için % 0.1 (w/v) pepsin içeren 1:20 (w/v) oranda %5’lik laktik asit çözeltisi içinde 6 saat bekletilmiştir. Ardından 3 farklı sıcaklık (20± 2°C, 25±2°C ve 30± 2°C) ve sürede (20, 40, 60 dk.) ultrason destekli ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işleminin ardından örnekler saflaştırma işlemi için diyaliz edilerek -56°C’de 32 sa boyunca dondurarak kurutulmuştur. En yüksek kolajen konsantrasyonuna 25°C-60 dk parametresinde (5061,75±171,41 µg/µl) ulaşılmıştır. SDS-PAGE elektroforez ve FTIR analizi sonuçları, farklı sıcaklık ve sürelerde uygulanan ultrason işleminin, kolajen yapısına zarar vermediğini ve tüm kolajenlerin yapısal bütünlüğünü koruduğunu göstermiştir. SEM analizi sonucunda, tüm kolajen örneklerinin lifli ve gözenekli yapıya sahip olduğu gözlenmiştir. Kolajen örneklerinin b* ve L* değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Örneklerin a* değerleri arasındaki fark ise sadece dört grup için anlamlı bulunmuştur (p<0.05). Çalışmanın ikinci aşamasında, GAG eldesi için uygun ekstraksiyon parametreleri belirlenmiştir. Ekstraksiyon işleminde papain enzimi ve sodyum asetat çözeltisi kullanılmıştır. Katı:çözgen oranı 1:20 (w/v), enzim miktarı (5 mg papain / 1 gr kuzu ayağı), sıcaklık (60°C) ve ekstraksiyon süresi 20 saat olarak belirlenmiştir. 20 saat ekstraksiyon işleminin ardından ultrason uygulamasının etkilerinin incelenmesi amacıyla, 3 farklı sıcaklık (60± 2°C, 65± 2°C ve 70± 2°C) ve sürede (20, 40, 60 dk.) ultrason destekli ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işleminin ardından örnekler saflaştırma işlemi için diyaliz edilerek -56°C’de 24 sa boyunca dondurarak kurutulmuştur. En yüksek kondroitin sülfat konsantrasyonuna 60°C-20 dk parametresinde (471,38±49,96 mg/L) ulaşılmıştır. FTIR analizi sonucunda, farklı ekstraksiyon koşulları altında elde edilen GAG örnekleri ile standarda ait spektrumlarının benzerlik gösterdiği görülmüştür. SEM analizi sonuçları, GAG örneklerindeki kümeleşmiş yapının ultrason süresi ve sıcaklığına bağlı olarak değiştiğini göstermiştir. Genel olarak farklı sıcaklık ve sürelerde uygulana ultrason işleminin GAG örneklerinin renk değerleri üzerine anlamlı bir etkisi olmadığı görülmüştür.