EMBRİYONİK KÖK HÜCRELERDE HİSTON TİPLERİNİN GLİKOZİLASYON PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ
Proje no. 564 · Durum: Kapanmış · 2014
Özet
Gelişim sürecinin erken basamaklarında yer alan embriyonik kök hücreler, gen ekspresyonu açısından oldukça aktiftir. Tüm gen bölgelerinin açık olması ve gen ekspresyonunun sağlanabilmesi için kromatin yapısının buna uygun düzenlenmesi gerekmektedir. Gen regülasyonunun kontrol mekanizmalarından biri olan histon modifikasyonlarından biri de glikozilasyondur ve bu konuda çok sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu nedenle projenin amacı; embriyonik kök hücrelerde histon tiplerinin olası glikozilasyon bölgelerini biyoinformatik açıdan irdelemek ve bu bilgilerden hareketle denizkestanesi Paracentrotus lividus’un embriyonik kök hücrelerinde histon glikozilasyon profilini deneysel olarak ortaya koymaktır. Bunun için; biyoinformatik çalışmada kullanılan histon proteinlerine ait amino asit dizileri NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ve UniProt (http://www.uniprot.org) veri tabanları üzerinden elde edildi. Potansiyel glikozilasyon bölgelerinin/pozisyonlarının tahmininde; NetNGlyc 1.0; NetOGlyc 4.0 ve YinOYang 1.2 sunucuları kullanıldı. Daha spesifik özelliklerin belirlenmesi için ISOGlyP, NetSurfP v.1.1, Polyview-2D SABLE gibi sunuculardan yararlanıldı. Deneysel çalışmalar için erişkin denizkestanelerinden elde edilen yumurta ve spermler, filtre edilmiş yapay deniz suyunda döllendirildi. 64-128 hücreli safhaya ulaşan embriyolarda histonların yapısındaki glikan çeşitleri lektin blotlama ile araştırıldı. Biyoinformatik açıdan değerlendirildiğinde; denizkestanesinde N-glikozilasyon bölgeleri sadece H1’de saptandı. O-glikozilasyonun musin tipi tüm histon tiplerinde saptanırken, O-ß-GlcNAc modifikasyonu sadece H1 ve H2A’da belirlendi. Tüm histon tiplerinde potansiyel glikozilasyon pozisyonlarının tümünün yüzey erişilebilirliği açık ve sekonder yapı motifi sarmal yapı olarak bulundu. Sıvı erişilebilirliği açısından ise; H1 ve H2B yüksek, H2A ve H3’de hem yüksek hem de düşük, H4’de düşük olarak belirlendi. Glikozilasyon pozisyonlarının ağırlıklı olarak proteinlerin N-terminal domainlerinde yer aldıkları saptandı. Deneysel açıdan değerlendirildiğinde; küçük moleküler ağırlıklı (~11- 22 kDa) proteinler olan histonlara ait protein bantları SDS-PAGE ile 11-22 kDa arasında belirgin şekilde elde edildi. Membrana aktarılmış histon protein bantlarında en iyi reaksiyon, terminal mannoza spesifik GNA lektini ile elde edildi. ?2,3 bağlı sialik asite spesifik MAA lektinle de reaksiyon görülürken, SNA, PNA ve DSA lektinlerle reaksiyon gerçekleşmedi. Sonuç olarak; hücrelerin farklılaşma sürecinde histon modifikasyonlarının önemli rol oynadığı bilinmektedir. Bunlardan biri olan glikozilasyonun da bir alternatif olarak gen ekspresyonu seviyesinde epigenetik açıdan anlaşılamayan bazı noktaları aydınlatabileceği düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: Histon, Glikozilasyon, Biyoinformatik, Lektin blotlama, Kök hücre, Paracentrotus lividus.