Amniyon Membran Ekstraktının Derinin Deneysel Yara Modelinde Etkinliğinin Değerlendirilmesi
Proje no. 30746 · Durum: Kapanmış · 2023
Özet
<p>İnsan amniyon membranı (iAM); plasentanın epitel, bazal membran ve stromadan oluşan, kalınlığı 0.002-0.5 mm arasında değişen</p><p>en iç tabakası olup; sitokinler, büyüme faktörleri (VEGF, PDGF, bFGF), Tip I, III, V, VII kollajen, fibronektin ve laminin içeriğinden zangin</p><p>bir ekstrasellüler matrikse sahiptir. Kalın bazal mebran üzerinde yerleşen tek sıralı epitelden oluşan yüzeyi düz ve parlaktır. Bazal</p><p>membranın apoptozisi baskılayıcı, ayrıca epitel adezyonu, migrasyonu ve diferensiasyonunu hızlandırıcı özellikleri bilinmektedir.</p><p>Avasküler stromaya sahip olan amniyon membranda immünojenitesi düşük multipotent kök hücreler bulunmaktadır.</p><p>Yapılan çalışmalarla amniyon membranının anti-inflamatuvar, anti-anjiojenik ve epitelizan özellikleri ile ilgili ümit verici sonuçlar</p><p>ortaya konmaktadır. Elde edilmesi kolay olan amniyon membranının son yıllarda tıpta birçok alanda, özellikle oftalmolojide ve yara</p><p>bakımında yaygın kullanımı bulunmaktadır. Plastik cerrahide deri yaralanmalarında kullanılmakla beraber oral, genital, oküler ve</p><p>diğer organ rekonstrüksiyonlarında da sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır.</p><p>Yara iyileşmesi insan vücudunun doğal biyolojik süreci olup dermal ve epidermal dokunun rejenerasyonunu kapsar. Reepitelizasyon,</p><p>keratinositlerin yaranın kenarından yara merkezine doğru göçüyle oluşan son ve çok önemli aşamadır. Ancak önemli doku kaybı olan</p><p>geniş yüzeyli veya derin yaralarda, genellikle inflamatuvar veya proliferasyon aşamalarının uzaması ile yara iyileşmesi gecikmekte ve</p><p>akut yaralar iyileşmeyen kronik yaralar haline gelebilmektedir. Bu durumda mevcut yaranın kapatılması için deri greftleri, flepleri</p><p>kullanımı ihtiyacı doğmaktadır. Ancak hastaların ek hastalıkları, genel durumlarındaki bozukluk, özellikle geniş yüzey yanık</p><p>hastalarında verici saha yetersizliği gibi nedenlerle yara kapatılması amaçlı ameliyat dışı alternatif tedavilere yönelme ihtiyacı ortaya</p><p>çıkabilmektedir. Ayrıca diyabetik yaralar, bası yaraları, periferik arter hastalığına bağlı dolaşım ve nörotrofik bozukluklardan</p><p>kaynaklanan yaralarda cerrahi başarısı düşük olup yaraların kısa zamanda nüks etme ihtimali yüksektir. Buna bağlı tekrarlayan</p><p>ameliyatlarla bu hasta profilinde rekonstrüksiyon basamağındaki seçenekler hızla tüketilmektedir. Bu nedenle yara iyileşmesinde</p><p>kullanılabilecek daha pratik ve morbiditesi düşük medikal yöntemlerin geliştirilmesi amaçlı çalışmalar yürütülmektedir. Amniyon</p><p>membranı geniş yaralarda, yanıklarda, epidermolizis büllosa gibi deri hastalıklarında, derinin iyileşmeyen kronik ülseratif yaralarında</p><p>bu amaçla uzun süredir yara örtüsü olarak kullanılan ancak etki mekanizmaları tam olarak açıklanmamış olan bir tedavi yöntemidir.</p><p>Amniyon membranının yanık hastalarında hem yanık alanı üzerine, hem greft donör sahasında biyolojik örtü olarak kullanımı sonrası</p><p>ağrının azalması, epitelizasyonun hızlanması, skar formasyonunun daha kabul edilebilir olması gibi etkileri bilinmektedir. Literatürde</p><p>geniş ve derin yaralarda hızlı epitelizasyon sağlayarak deri grefti ihtiyacının ortadan kaldırıldığını gösteren çalışmalar vardır.</p><p>Oftalmolojide sıklıkla kriyoprezervasyonla hazırlandıktan sonra iAM'ın gözün ön yüzeyine tesbiti işlemi olan amniyon membran</p><p>transplantasyonu (AMT) şeklinde kullanılmaktadır. Yara ve yanıkların tedavisinde, re-epitelizasyonu sağlamak amacıyla uygulanan amniyon membran</p><p>transplantasyonu etkili ve güvenli bir yöntemdir. Sıklıkla kriyoprezervasyonla hazırlandıktan sonra oftalmolojide “iAM transplantasyonu”, deri yaralarında ise biyolojik pansuman</p><p>şeklinde kullanılmaktadır.</p><p>Amniyon membranının bu tür kullanım şeklinin cerrahi gerektirmesi, saklama süresinin kısıtlı olması, içeriğinin kontrol edilememesi,</p><p>istenilen süre kadar kullanılamaması ve yarı opak yapısı nedeniyle objektif klinik gözlemin yapılamaması gibi kısıtlılıkları</p><p>bulunmaktadır. Bu kısıtlılıkları azaltmak adına amniyon membran ekstraktının (AME) hazırlanması, uygun saklama koşullarının</p><p>sağlanması amacıyla liyofilize edilmesi ve buradan hareketle uygun çözeltinin hazırlanarak bunun klinikte uygulanması görüşü</p><p>doğmuştur. AME sözü geçen kısıtlılıkları ortadan kaldırabilme potansiyeline sahip alternatif tedavi formudur.</p><p><br></p><p>AME eldesi ve saklanması ile ilgili günümüzde halen birçok aktif çalışma sürdürülmektedir. Ege Üniversitesi bünyesinde Göz</p><p>hastalıkları bölümü tarafından 2020 Haziran ayı itibariyle öncelikli alan projesi kapsamında ulusal platformda AME ürünü geliştirmek</p><p>üzere yüksek bütçeli bir araştırma başlatılmış bulunmaktadır. Proje başlangıç tarihinden günümüze kadar geçen süreçte, AME eldesi</p><p>sağlanmış, AME'nin protein analizi gerçekleştirilmiş olup; yöntem için patent başvuru hazırlığı yapılmaktadır. Yüksek protein içeriğinin</p><p>gösterildiği erken çalışma raporu doğrultusunda, AME'yi ürüne dönüştürme yolunda derideki yaralar üzerine etkinliğini araştırmayı</p><p>planladığımız hayvan deneyleri önemli bir basamağı oluşturmaktadır. Deri yaraları amniyon membran kullanımının dolayısıyla bu</p><p>ürünün de klinikte en sık kullanım alan bulacağı patolojilerden birini oluşturmaktadır. Bu bilgi doğrultusunda AME'nin deneysel deri</p><p>yara modelinde etkinliğini araştırmayı planlanmaktayız.</p><p><br></p><p>Bu çalışmada ülkemizde ilk kez literatür ile uyumlu şekilde havuz oluşturulmuş örneklerden steril liyofilize toz formunda hazırlanan AME</p><p>kullanılarak, protein ve büyüme faktörleri içeriği belirlenerek standardize edilmiş AME’nin deneysel deri yara modelinde etkinliği araştırılacaktır.</p><p>Bu araştırmanın özgün değerini, uygulanacak olan AME’nin dünyada ilk kez klinik uygulama ile korele edilerek içeriği standardize hale getirilmiş</p><p>formunun hazırlanması ve bu formun deneysel deri yara modelinde tedavi edici etkinliğinin değerlendirilmesi oluşturmaktadır.</p><p>Çalışmada bu amaçla klinik uygulamadaki amniyon miktarı göz önüne alınarak hesaplanan total protein ve büyüme faktörü konsantrasyonu</p><p>sabitlenmiş ve ürüne dönüşme potansiyeli yüksek preparatın deneysel deri yara modelindeki tedavi edici etkinliğini antibiyotikli pansuman</p><p>ile kıyaslanarak araştırılacaktır. Amniyon membran ekstraktının etkinliğinin, derinin deneysel yara modelinde değerlendirilmesini amaçladığımız çalışmada; amniyon membranın içerik olarak büyüme faktörleri ve kollajenlerden zengin olmasının yanı sıra anti-inflamatuvar, anti-anjiojenik ve epitelizan özellikleri sayesinde yara iyileşmesinde hem klinik olarak hem de histopatolojik olarak olumlu etkilerinin görülmesini beklemekteyiz.Çalışma sonuçlarının hem ulusal hem uluslararası toplantılarda bildiri olarak sunulması ve yüksek endeksli dergilerde yayımlanması planlanmaktadır. Ayrıca AME’yi ürüne dönüştürme yolunda derideki yaralar üzerine etkinliğini araştırmayı planladığımız hayvan deneyleri önemli</p><p>bir basamağı oluşturmaktadır.</p><p><br></p><p>Çalışmamızda bu amaçla 2 çalışma grubu, 1 kontrol grubu yer alacaktır. Kontrol grubunda 4, diğer gruplarda 6'şar hayvan olmak üzere toplam 16</p><p>adet rat kullanılacaktır. Tüm ratlara sedasyon için 90 mg/kg ketamin ve 5- 10 mg/kg ksilazin i.m veya sc olarak verilecektir.</p><p>İnfiltrasyon anestezisi ve profilaksi için 30mg/kg tek doz sefazolin uygulaması sonrası steril koşular altında tüm gruptaki hayvanların sırt bölgesi</p><p>tüyleri tıraş edildikten sonra %5’lik povidon iyot çözeltisi ile silinecektir. Ardından no15 bistüri yardımı ile yarıçapı 1.5 cm olan sirküler tam kat deri</p><p>defekti oluşturulacaktır. Yara yerini enfeksiyondan korumak için petrolatum ve klorheksidin içeren yağlı gaz kullanılacaktır. 1.5 cm yarıçaplı bir yarayı</p><p>kapatmak için 4x4 cm lik amniyon kullanılacaktır. AME hazırlığı içinse AMT cerrahisinde kullanılan 4x4 cm’lik amniyon membranının yaklaşık</p><p>ağırlığının 1 g olduğu bilgisi doğrultusunda, bu miktarda amniyonun sahip olduğu büyüme faktörlerini içermesi açısından 1 g/1 ml sulandırılmış AME</p><p>hazırlanacaktır. Ratların sırtındaki yara yerine Grup 1’de AME, Grup 2’de AMT tedavisi uygulanacaktır. Kontrol grubu dahil olmak üzere (Grup 3) tüm</p><p>ratların yara yerleri klorheksidin içeren petrolatum gauz (tulle gras) ile kapatılacaktır. AME hidrofil yapıda olup petrolatum gauz hidrofob yapıda olduğunda bu tür kapama şekli amniyon membran ekstaktını yara üzerinde tutmaya yetecektir. AME grubunda uygulama her 5 günde 1 yenilenecektir. Ratlar,</p><p>3 hafta süresince; 0., 7., 14. ve 21. günler olacak şekilde izlenecektir. İzlemde, tüm grupların yara yerlerinin klinik görünümü fotoğraflanacak, re-</p><p>epitelizasyonun süresi, re-epitelizasyon alanı değerlendirilecektir. Manüel planimetrik olarak yara iyileşmesi kayıt altına alınacak ve bu kayıtlar</p><p>üzerinden Matlab programı yardımıyla bilgisayar ortamında yara iyileşme hızı açısından analiz edilecektir. Tüm görüntü analizleri için Matlab 2022</p><p>programı kullanılacaktır. 0. gün görüntüsünde işaretlenen defekt alanı referans alan olarak alınmıştır. Öncelikle bu bölge tek başına elde edilip yarı</p><p>çapı ölçülmüştür. Ölçülen bu yarıçap her görüntünün en/boy oranına göre ilgili görüntü için yeniden hesaplanmıştır. Gerekli görüldüğünde manuel</p><p>olarak modifikasyon uygulanmıştır. Ardından her görüntü için el ile merkez nokta belirlenerek ilgili yarı çap içinde olması gereken tüm piksel</p><p>miktarına karşılık, defektin kapladığı piksel miktarı hesaplanmıştır. Tüm piksel miktarı 100% kabul edildiğinde defektif bölgenin yüzdelik oranı</p><p>tablolarda verilecektir. İzlem süresi sonunda ratlar intraperitoneal sodyum pentobarbital (100 mg/kg) uygulaması ile sakrifiye edilecektir. Yara yeri</p><p>çevre doku ile birlikte bütün olacak şekilde eksize edilerek %10’luk formaldehite konulacak ve ışık mikroskobisinde incelenmek üzere patoloji</p><p>laboratuvarına transfer edilecektir. Rutin patolojik takip sonrası parafine gömülen dokulardan 5 mikron kalınlığında kesitler elde edilecek ve kesitler</p><p>Hematoksilen-Eozin boyası ile boyanacaktır. Işık mikroskobik olarak deri yüzeyi yara iyileşmesi açısından semikantitatif olarak incelenecektir. Ödem,</p><p>mononükleer inflamatuvar hücre infiltrasyonu, fibroplazi, neovaskülarizasyon, epitelyal değişiklikler ve reaktif rejeneratif değişiklikler</p><p>değerlendirilecek ve semikantitatif olarak skorlanacaktır. Gruplar arası farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirilecektir. Kesitlerin dijital fotoğrafları</p><p>alınarak kaydedilecektir. Sonuçlar SPSS-15 programı ile (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Mann-Whitney U and chi-square testleri kullanılarak analiz</p><p>edilecektir. P değeri ≤0.05 istatistisel olarak anlamlı kabul edilecektir</p>