BİYOAKTİF KİTOOLİGOSAKARİTLERİN KANTİTATİF ANALİZİ VE KARAKTERİZASYONU
Proje no. 1307 · Durum: Kapanmış · 2016
Özet
Kitin ve kitosanın enzimatik veya kimyasal depolimerizasyonu ile kitooligosakkaritler (COS) elde edilmektedir. COS çok geniş alanda biyolojik aktiviteye ve çeşitli endüstrilerde dikkat çekici potansiyel uygulanma alanına sahiptir. Bu proje daha önce izole edilen ve tanımlanan yerli Bacillus suşları tarafından üretilen farklı kitosanaz enzimleri kullanılarak kitosanın enzimatik hidrolizi ile COS üretmek amacı ile planlanmıştır. Daha sonar Bacillus mojavensis için 37 kDa'lık bir kitosanaz iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış kitosanazın optimum sıcaklığı ve pH'sı sırasıyla 55°C ve 5,5 olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesinin %66'sının bir saat boyunca 55°C'de stabil olarak kaldığı ayrıca geniş bir pH (3,0-11,00) aralığında stabil olduğu saptanmıştır. Kitosanaz için optimum substrat çözünür kitosan olmuş ve çözünür kitosan ile enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,1 mg mL?¹ ve 244,5 µmol min?¹ mg?¹ olarak belirlenmiştir. Ayrıca, HPLC ile COS analizi için DAD detektörü ve Hypersil APS-2 kolonu kullanılarak bir gradiyent elüsyon yöntemi optimize edilmiştir. Bacillus suşlarının ham kitosanaz ekstraktları, kitosanı COS'lere hidrolize etmek için kullanılmış ve hidrolizatlar, optimize edilmiş yöntem kullanılarak HPLC ile kantitatif olarak analiz edilmiştir. 14 Bacillus suşunun ham kitosanaz ekstraktları, kitosanı COS'lere başarılı bir şekilde hidrolize edebilmiş ve polimerizasyon derecesi (DP) 2-6 arasında olan farklı oligomerler tespit edilmiştir. COS ürünlerinin relatif verimleri %11-31 aralığında belirlenmiş ve Bacillus thuringiensis EGE-B-3.5m suşunun ham kitosanaz ekstraktı ile en yüksek relatif verim (%31) elde edilmiştir. Ham kitosanaz ekstraktlarının çoğukitosanın hidroliz ürünü olarak kitobiyoz oluşturmuştur. HPLC metodu, COS karışımının etkili bir şekilde ayrılmasını sağlayabilmesine rağmen, sonuçların doğrulanması ve oligomerlerin doğru karakterizasyonu için LC-MS, MALDI-TOF-MS ve NMR analizinin yapılması gerekli olmuştur.