Metisilin dirençli klinik Staphylococcus aureus kökenlerinde antibiyotik direncinin CRISPR/dCas9 temelli genom düzenlemesi ile baskılanması
Proje no. 21898 · Durum: Kapanmış (Yayın bekleniyor) · 2020
Özet
Antibiyotik direnci gösteren mikroorganizmaların giderek artması sonucunda bu mikroorganizmalara bağlı gelişen bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde ciddi problemler ortaya çıkmaktadır. Bu problemler enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde farklı seçeneklerin potansiyellerini arttırmaktadır. Düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri (CRISPRs) ve ilişkili genleri (cas), bakteri ve arkelerin plazmid veya faj gibi yabancı DNA ya karşı geliştirdiği adaptif bağışıklık sistemlerinin temel bileşenleridir. CRISPR/Cas9 tekniği RNA aracılı genom düzenleme teknolojisi olmakla birlikte farklı alanlardaki birçok yenilikçi uygulamada kullanılmış ve elde edilen sonuçlar moleküler biyoloji için devrim yaratıcı nitelikte olmuştur. Proje amacımız; CRISPR/Cas9 sistemi ile ciddi bir tehdit olan klinik metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) kökenlerindeki metisilin, gentamisin ve siprofloksasin direnç genlerini hedefleyip, bu genlerin baskılanmasını sağlayarak bakterinin direnç profilinde değişiklik gerçekleştirmek ve bakterilerin antibiyotiklerin düşük konsantrasyonlarına duyarlı hale gelmesini sağlamaktır. Bu amaçla hedef bölgeye özgün olarak tasarlanan gRNA’ lar CRISPR vektörüne klonlanacaktır. Klinik kökenlerin bu rekombinant plazmid ile transformasyonu gerçekleştirilecek ve kloramfenikol içeren besiyerinde transformant seçimi ile doğrulama yapılacaktır. Fenotipik antibiyotik duyarlılık testleriyle zon çapı ve minimum inhibitör konsantrasyondaki değişim analiz edildikten sonra DNA izolasyonu ile polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) aşamasında gen bölgelerindeki değişim incelenecektir. Hedefleme sonucunda direnç genlerine ait nükleotid dizilimindeki değişimi ve hedef dışı değişiklikleri izlemek amacıyla sekans analizi yaptırılacaktır. Kantitatif gerçek zamanlı ters transkriptaz PZR (RT-qPCR) ve western blot ile direnç genlerinin ekspresyon düzeylerinde değişimi incelenecektir. CRISPR/Cas sistemi virülan veya antibiyotiklere dirençli mikroorganizmalara karşı en yeni savunma silahımız olabilir. Proje kapsamında dirence karşı yeni bir potansiyel terapötiğin in- vitro denemeleri yapılacaktır. Projemiz, çıktılarına bağlı olarak ileride in- vivo aşaması şekillendirilecek yeni çalışmaların başlangıcı olacaktır.