Kenevir tohumu unu protein izolatlarının biyoaktivitelerinin belirlenmesi

Proje no. 24033 · Durum: Kapanmış (Yayın bekleniyor) · 2022

Özet

1. ÖZET ve ANAHTAR KELİMELER: Projenin kapsamı, yöntemi, konunun özgün değeri ve beklenen sonuçlar kısaca belirtilmelidir. Proje özetinin 150-250 kelime arasında olması beklenir.Son bilimsel araştırmalar, kenevir tohumunun değerli bir besin kaynağı olduğunu göstermiştir. Gıda atıklarının proteinler, diyet lifleri, antioksidanlar ve diğer besinler açısından zengin olması nedeniyle gıda atıklarının yeniden kullanımı sürdürülebilirlik için önemlidir. Bu anlamda, yağ üretiminden sonra kalan yağlı tohum küspeleri, değerli protein kaynakları olarak kabul edilmektedir. Potansiyel sağlık faydalarına rağmen çok araştırılmamış yağlı tohum küspelerinden kenevir unu, kenevir tohumlarından yağ üretiminden sonra kalan atıktır. Kenevir tohumları genellikle %30’un üzerinde yağ ve yaklaşık olarak %25 oranında protein içermektedir. Kenevir tohumu, insan vücudunun sentezleyemediği ve dışardan besin yoluyla alınması gereken dokuz temel aminoasitin tümüne sahiptir. Kenevir unu protein izolatları, besleme kaynağı olarak kullanılmak için iyi bir potansiyele sahiptir. Zayıf protein çözünürlüğü bu proteinin birçok alanda kullanımı sınırlamaktadır. Projede atık olan kenevir tohumu ununun substrat olarak kullanılarak potansiyel sağlık faydası olan protein hidrolizatlarının elde edilmesi ve bu proteinin farklı alanlarda kullanımının genişletilmesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla kenevir tohumu unundan ticari bir enzim olan alkalaz kullanılarak farklı reaksiyon koşullarında protein hidrolizatları hazırlanacaktır. Protein hidrolizatlarının reaksiyon koşullarına göre hidroliz derecesi belirlenecek, moleküler fraksiyonlama yapılacak, sonrasında ayırma prosedürleri gerçekleştirilecektir. Elde edilen protein izolatları, hidrolizatları ve hidrolizat fraksiyonlarının toplam antioksidan kapasitesi ABTS VE DPPH yöntemleri belirlenecektir. Antidiyabetik etkinin araştırılması için alfa-glukozidaz ve maya hücresine glikoz alımını engelleme denemeleri yapılıp, en etkili fraksiyonlar belirlenerek, tavuk embriyosu modelinde (HET-CAM) kullanılacaktır. Tavuk embriyosunda kenevir unu hidrolizatlarının antidiyabetik etkisi kontrol gruplarıyla birlikte incelenecektir. Bu sayede daha önce kenevir unu protein izolatlarına uygulanmamış bir antidiyabetik aktivite belirleme metodu kullanılarak, elde edilen hidrolizatlardan antioksidan ve antidiyabetik etki gösteren bileşikler belirlenebilecektir.Anahtar Kelimeler: Kenevir tohumu, protein hidrolizatı, antidiyabetik, antioksidan aktivite, alkalaz, enzimatik hidroliz, HET-CAM  2. AMAÇ / GEREKÇE: Önerilen projenin amacı ve gerekçesi açıkça yazılmalıdır.Projenin amacı yüksek biyoaktiviteye sahip olan, düşük ya da sıfır toksisite gösteren ve insan metabolizmasında kolaylıkla sindirilebilmeleri gibi özellikleri ve kan basıncını kontrol altına alma, kolesterol ve lipit düşürücü etki, bağışıklık sistemini güçlendirme/düzenleme, enflamasyonu azaltma gibi sağlığa olumlu etkileri bulunan protein hidrolizatlarının kenevir unu atığından ticari bir enzim kullanılarak eldesinin gerçekleştirilmesi ve literatürde kenevir unu proteinlerinin antidiyabetik aktivitelerinin belirlenmesinde tavuk embriyosu modeli uygulanarak antidiyabetik hidrolizat terapötiklerin geliştirilmesi için referans bir model oluşturması sağlanması, aynı zamanda fonksiyonel gıda uygulamalarında kullanılabilecek ürünler üretilerek atık olan kenevir unundan potansiyel sağlık faydası olan bileşikler elde etmektir.Son yıllarda kimyasal olarak sentezlenen ilaçların olası yan etkileri nedeniyle araştırmalar özellikle gıdalardan ve gıda atıklarından biyoaktif maddelerin eldesi ve tanımlanmasına yönelmiştir. Tip 2 diyabet milyonlarca insanı olumsuz etkileyen küresel bir sağlık sorunudur. Kullanılan antidiyabetik ilaçlara rağmen, çok sayıda hasta tedavide olumlu sonuç alamamakla birlikte bu ilaçların maliyetleri ve yan etkileri yüksektir. Yüksek oranda protein içeren ve biyoaktivite gösteren kenevir tohumu unundan elde edilebilecek biyoaktif maddeler ile Tip 2 diyabet tedavisinde tek başına ya da farmakolojik ilaçların etkisini iyileştirmede kullanılacak bileşiklerin belirlenmesi mümkündür. Kenevir tohumu unu gibi çeşitli atıkların biyoaktivite gösteren maddelerin üretimi için değerlendirilmesi çevre kirliliğinin önlenmesinde ve atık yönetiminde fayda sağlamakla birlikte bu atıklardan katma değeri yüksek ürünlerin eldesi içinde cazip bir alternatif oluşturmaktadır.   3. KONU ve KAPSAM: Önerilen projenin konusu ve kapsamı net olarak tanımlanmalı; amaç ile ilişkisi açıklanmalıdır. Araştırmanın problemi ve hipotezleri net olarak ortaya konulmalıdır.Diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve obezite gibi bulaşıcı olmayan kronik hastalıkların, 2019 yılında dünya çapında ölümlerin %70'ine yol açtığı Dünya Sağlık Örgütü tarafından bildirilmiştir. Diyabet tedavisi için insülin ve çeşitli sentetik oral hipoglisemik ajanlar mevcut olmasına rağmen, insülin enjeksiyonu ve sentetik ajanlarla ilişkili ciddi yan etkileri nedeniyle düşük toksisite gösteren, ağızdan alımı kolay olan yeni antidiyabetik ajanların talebini ve gerekliliğini göstermektedir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu oksidatif stres, çeşitli kronik bulaşıcı olmayan hastalıkların ana nedenidir. ROS oluşumunu azaltmak, antioksidan enzim aktivitesini arttırmak, bulaşıcı olmayan kronik hastalıkları önlemek ve iyileştirmek için ideal bir yoldur. Günümüzde klinikte yaygın olarak kullanılabilen birkaç farmasötik antioksidan vardır. Antioksidan ilaçların geliştirilmesi oldukça büyük miktarda para ve zaman gerektirir. Gıda proteininden türetilen peptitler, in vitro ve in vivo olarak doğrulanmış doğal antioksidanlardır. Chia tohumu ve soya fasulyesi gibi protein hidrolizatlarından elde edilen peptitlerin, hücre içi ROS oluşumunu regüle ettiği bilinmektedir. Şimdiye kadar, birkaç bitkinin klinik uygulamada antidiyabetik etkiye sahip olduğu onaylanmıştır. Bu nedenle, güvenli ve oral hipoglisemik ajanlar ve doğal antioksidan üretimi için bir gıda kaynağı bulmak son derece önemlidir (Gao ve ark., 2021; Udenigwe and Aluko, 2012). Yaygın olarak kenevir olarak adlandırılan Cannabis sativa L.'nin endüstriyel çeşidi, yüksek besin değerine sahiptir ve çoklu doymamış yağ asitleri, proteinler, diyet lifi, vitaminler ve mineraller bakımından zengindir. Bazı ülkelerde büyük endüstriyel öneme sahip, yaygın olarak yetiştirilen bir bitkidir ve tohumu, tarih boyunca çiğ, pişmiş ve kavrulmuş değerli bir besin kaynağıdır. Kenevir tohumunun yüksek kaliteli proteinler içerdiği (edestin ve albümin) esansiyel amino asitler açısından zengin ve kolayca sindirilebilir olduğu bildirmiştir. Bununla birlikte, kenevir sadece kenevir tohumu yağı için ekilmekte ve bu da bol miktarda protein israfına neden olmaktadır (Pojić ve ark. 2015; Ren ve ark., 2016). Kenevir tohumu proteinini içeren araştırmalar fonksiyonel özelliklerinin çok sayıda gıda formülasyonunda uygulamasını büyük ölçüde sınırladığını göstermiştir. Bu nedenle, bu besleyici proteini kullanmak ve istenmeyen özelliklerini geliştirmek için modern tekniklerin kullanılması gerekmektedir. Kenevir tohumu unu proteinleri için yapılan çalışmalar çok sınırlı olmasına rağmen antihipertansiyon, α-glukozidaz inhibisyonu ve antioksidasyon dahil olmak üzere çeşitli biyoaktivitelere sahip peptitlere hidrolize edilebilmiştir. Hayati bir sindirim enzimi olan α-glukozidaz, dekstrini glikoza parçalar ve vücudumuzda glikoz metabolizmasının sürdürülmesi için çok önemli bir faktör olarak kabul edilir. Genel olarak, α-glukozidaz aktivitesi üzerindeki inhibisyon etki örneklerin hipoglisemik aktivitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir (Malomo ve Aluko 2016; Ren ve ark., 2016; Gao ve ark., 2021). Bu projenin amacı kenevir tohumu unu proteinlerin izolatlarını substrat olarak kullanarak enzimatik hidroliz ile antidiyabetik ve antioksidan özellik gösteren protein hidrolizatlarının biyoaktivitelerinin belirlenmesidir. Proje ile düşük maliyetli bir atık kullanılarak, katma değeri yüksek fonksiyonel gıda uygulamalarında veya terapötiklerin geliştirilmesi istenmektedir. Literatürde kenevir ununda antioksidan etki ile ilgili çalışmalar olmasına rağmen antidiyabetik etki için tek bir çalışma bulunmaktadır. Antidiyabetik aktivitenin belirlenmesinde maya hücresine glikoz alımını engelleme ve tavuk embriyo (HET-CAM) metodu kullanılmamıştır. Projede antidiyabetik aktivitelerinin belirlenmesinde tavuk embriyosu modeli uygulanarak antidiyabetik hidrolizat terapötiklerin geliştirilmesi ve ticari üretimi için referans bir model oluşturması sağlanacaktır.   4. LİTERATÜR ÖZETİ: Proje konusu ile ilgili alanda ulusal ve uluslararası literatür taranarak, özet bir literatür analizi verilmelidir. Bu analizde, önerilen araştırma konusunun literatürdeki önemi, arka planı, bugün gelinen durum, yaşanan sorunlar, eksiklikler, doldurulması gereken boşluklar vb. hususlar açık ve net bir şekilde ortaya konulmalıdır. Literatür değerlendirmesi yapılırken ham bir literatür listesi değil, ilgili literatürün özet halinde bir analizi sunulmalıdır.Diabetes mellitus (DM), dünya çapında önemli sağlık sorunlarından biri olarak kabul edilen metabolik bir hastalıktır. Dünyada 2018 yılında 336 milyon kişide olduğu bildirilen diyabetin, 2030 yılına kadar 552 milyon kişide olacağı tahmin edilmektedir. Tip 2 diabetes mellitus (T2DM), karbonhidrat, lipit ve protein metabolizmasının düzensizliği ve bozulmuş insülin sekresyonu, insülin direnci veya her ikisinin bir kombinasyonundan kaynaklanmaktadır ve tüm DM vakalarının %90'ının T2DM olduğu bilinmektedir. T2MD hem batı dünyasında hem de gelişmekte olan ülkelerde milyonlarca insanı olumsuz etkileyen küresel bir sağlık sorunudur ve kullanılan antidiyabetik ilaçlara rağmen, çok sayıda hasta tedavide olumlu sonuç alamamaktadır. T2MD tedavisinde kullanılan farmakolojik ilaçlar sulfonilüreler, metformin, tiazolidindionlar, metglinidlerdir. Belirtilen ilaçların maliyetleri ve yan etki ihtimali yüksektir. Kan şekeri kontrolünde farmakolojik pek çok ilaç bulunmasına rağmen daha etkili ve yan etki ihtimali düşük yeni ilaçlar geliştirilmesi gerekmektedir (Kahn et al., 2014; González-Montoya et al., 2018).Beslenmede yer alan fonksiyonel gıdaların potansiyel bileşenleri olarak biyoaktif peptitlerin elde edildiği protein hidrolizatları; yüksek biyoaktiviteye sahip olmaları, düşük ya da sıfır toksisiteleri ve insan metabolizmasında kolaylıkla sindirilmeleri gibi avantajları sayesinde günümüzde ilgi çekici hale gelmişlerdir. Gıda kaynaklı biyoaktiflerin, kan basıncını kontrol altına alma, kolesterol ve lipit düşürücü etki, bağışıklık sistemini güçlendirme/düzenleme, enflamasyonu azaltma gibi sağlığa olumlu etkileri bulunmaktadır. Son yıllarda kimyasal olarak sentezlenen ilaçların olası yan etkileri nedeniyle araştırmalar özellikle gıdalardan ve gıda atıklarından biyoaktif maddelerin eldesi ve tanımlanmasına yönelmiştir (Tu et al., 2018). Bu nedenle protein içeren gıdalardan veya gıda atıklarından elde edilebilecek biyoaktifler ile Tip 2 diyabet tedavisinde tek başına ya da hazırda kullanılan farmakolojik ilaçların etkisini iyileştirmede ek bir alternatif olarak kullanılabilir (Udenigwe and Aluko, 2012).Biyoaktif peptitler; enzimatik hidroliz, fermantasyon, bu iki işlemin birlikte gerçekleştirilmesi ya da ısı ve yüksek basınç uygulaması gibi durumlarda açığa çıkabilmektedir. Bunların yanında gıdaların son ürünlere işlenmesi sırasında ya da insan sindirim sisteminde enzimlerin etkisiyle biyoaktif peptitlerin açığa çıkabildiği de bilinmektedir. Biyoaktif peptitlerin üretilmesi ve tanımlanmasında kullanılan genel yöntem ise uygun protein kaynağının belirlenmesi, enzimatik hidroliz ile peptit fragmentlerinin protein yapısından ayrılarak açığa çıkması, membran ayırma ya da kromatografik yöntemlerle izolasyon ve peptitlerin aktivitelerinin doğrulanması şeklindedir (Li-Chan, 2015).Kenevir olarak adlandırılan Cannabis sativa L., önemli bir gıda, lif ve ilaç kaynağı olarak endüstriyel öneme sahip, yaygın olarak yetiştirilen sürdürülebilir bir bitkidir. Kenevir lifinin ticari kullanımından sonra kenevir tohumları bir yan ürün haline gelmektedir. Kenevir tohumları yetiştirilen bölgeye göre değişmekle birlikte genel olarak %30’un üzerinde yağ ve yaklaşık olarak %25 oranında protein içermektedir. Bu tohumlar yağı için kullanılmakta ve bu da bol miktarda yağsız kenevir unu atığına neden olmaktadır. Kenevir ununda bulunan proteinler kolay sindirebilir ve tüm temel aminoasitler açısından zengin bir kaynaktır. Esas olarak edestin (globulin) ve albüminden oluşmaktadır. Kenevir unu protein izolatları, besleme kaynağı olarak kullanılmak için iyi bir potansiyele sahip olmasına rağmen, protein çözünürlüğü olarak çok zayıf fonksiyonel özellikler göstermektedir. Zayıf fonksiyonel özellikler, bu proteinin birçok alanda kullanımı sınırlamaktadır (Tang et al., 2009; Aluko, 2017; Ren et al., 2016).Kenevir ununun potansiyel özelliklerinin geliştirilmesi için birçok çalışma yapılmıştır. Yin ve ark. (2007), kenevir unu protein izolatlarının fonksiyonel özelliklerini geliştirmek için tripsin ile enzimatik hidroliz tekniğini uygulamış ve bu tekniğin protein çözünürlüğünü iyileştirmek için etkili olduğu ama diğer fonksiyonel özelliklerde düşüşe yol açtığını bildirmiştir. Bununla birlikte, farklı enzimler kullanılarak kenevir unu protein izolatlarına enzimatik hidroliz yapılmış, antihipertansif, antioksidan ve besleyici özellikleri incelenmiştir. Enzimatik hidroliz ile yüksek katma değerli ürünlerin üretilebileceği görülmüştür (Tang et al., 2009). Yapılan literatür taramasında kenevir tohum proteinlerine alkalaz ile uygulanan enzimatik hidroliz sonucunda alfa-glukozidaz inhibitör etkisi olan iki oligopeptit tanımlandığı tek bir çalışma belirlenmiştir (Ren et al., 2016).Bu proje önerisinde kenevir unundan alkalaz enzimi ile farklı reaksiyon koşullarında protein hidrolizatları hazırlanacaktır. Protein hidrolizatlarının hidroliz derecesi belirlenecek, sonrasında ayırma prosedürleri gerçekleştirilecektir. Elde edilen protein izolatları, hidrolizatları ve hidrolizat fraksiyonlarının toplam antioksidan kapasitesi ABTS ve DPPH yöntemleri ile belirlenecektir. Antidiyabetik etkinin belirlenmesi amacıyla alfa-glukozidaz ve maya hücresine glikoz alımını engelleme denemeleri yapılıp, en etkili fraksiyonlar belirlenerek, tavuk embriyosu modelinde kullanılacaktır. Tavuk embriyosunda kenevir unu hidrolizatlarının antidiyabetik etkisi kontrol gruplarıyla birlikte incelenecektir. Bu sayede daha önce kenevir unu protein izolatlarına uygulanmamış bir antidiyabetik aktivite belirleme metodu kullanılarak, elde edilen hidrolizatlardan antioksidan ve antidiyabetik etki gösteren bileşikler belirlenebilecektir.   5. ÖZGÜN DEĞERİ: Araştırmanın dayandığı hipotez(ler) açıkça ortaya konulmalı ve proje konusunun bilgi birikimi içindeki yeri, hangi boşluğu dolduracağı belirtilmelidir. Önerilen yeni teknoloji, yöntem veya kuramın literatüre nasıl bir katkı sağlayacağı açıklanmalıdır.Literatür araştırmaları neticesinde kenevir unu protein izolatlarının enzimatik hidrolizi çalışılmış olup, antioksidan ve antidiyabetik etki için enzimatik hidroliz optimizasyonunun yapılmadığı sonucuna ulaşılmıştır. Projenin amaçlarından biri olan kenevir unundan elde edilen hidrolizatların antidiyabetik etkisinin belirlenmesinde tavuk embriyo modelinin kullanılması daha önce literatürde denenmemiş bir yöntemdir. Bu bağlamda bu tez çalışmasının çıktılarının literatüre kazandırılmasıyla kenevir unu hidrolizatlarının ticari olarak elde edilmesinin optimizasyonu ve antidiyabetik ve antioksidan etkilerinin belirlenmesi ile ilgili ilerideki araştırmalara katkı sağlayacağı öngörülmektedir.   6. YAYGIN ETKİ/KATMA DEĞER: Projenin gerçekleştirilmesi sonucunda bilimsel birikime, ulusal ekonomiye ve toplumsal refaha yapılabilecek katkılar ve sağlanabilecek yararlar tartışılmalı, elde edilmesi umulan sonuçlardan kimlerin ne şekilde yararlanabileceği belirtilmelidir.Kenevirin tohumu, sapı ve çiçeği kâğıt, kumaş, tekstil ve kozmetik gibi birçok sanayi kolunda kullanılmaktadır. Birçok ülkede olduğu gibi Türkiye’de de kenevir tohumu üretimi uzun süre geri planda kalmıştır. Bunda yapraklarının esrar yapımında kullanılması nedeniyle çiftçinin bitkiye önyargı ile yaklaşılması ve kanun, yönetmelik ve mevzuatlar da üretimin sınırlı kalması da rol oynamıştır. Türkiye’de kenevir, 2019 yılında düzenlenen “Cumhurbaşkanlığı Hükümet Sisteminde Yerel Yönetimler Sempozyumunda” yeniden gündeme gelmiş ve “Türkiye’de Endüstriyel Kenevir Yetiştiriciliği Raporu ve Eylem Planı” hazırlanmıştır ve 2019 yılı itibariyle endüstriyel amaçlı kenevir ekiminin 19 ilde serbest bırakılmasına karar verilmiştir. Türkiye’nin son dönemdeki kenevir politikası incelendiğinde, kenevir üretiminin yerli ihtiyaçları karşılayacak şekilde üretilmesi ve yaygınlaştırılması amaçlanmaktadır. Kenevir tohumunun yüksek kaliteli proteinler içerdiği esansiyel amino asitler açısından zengin ve kolayca sindirilebilir olduğunu bilinmektedir. Kenevir tohumu yağı için kullanıldıktan sonra yağsız kenevir ununun kullanılmaması bol miktarda protein israfına neden olmaktadır. Kenevir tohumu proteininin fonksiyonel özelliklerinin gıda formülasyonunda uygulamasını büyük ölçüde sınırladığını göstermiştir. Bu nedenle, bu besleyici proteini kullanmak ve istenmeyen özelliklerini gidermek için enzimatik hidroliz yapılacaktır. Kenevir tohumu unundan protein hidrolizatlarının üretimi ile biyoaktivite gösteren katma değeri yüksek ürünler elde edilecektir. Aynı zamanda atık yönetimine yardımcı olacaktır. Kenevir tohumu için yapılan çalışmalar kapsamında antioksidan ve antidiyabetik etki gösteren ürünler elde edilmesi ve bunların tanımlanarak ticari olarak üretilmesi mümkün olabilir. Antidiyabetik etkinin belirlenmesi için pre-klinik çalışmalardan önce canlı sistemler üzerindeki etkisinin incelenmesi sağlanabilir. Katma değeri yüksek bir ürün olarak biyoaktivite gösteren protein hidrolizatlarının hazırlanması ile kenevir üretiminin sürdürülebilir bir şekilde geliştirilebilmesi ve planlanması için üretim sürecinde çıkan atıkların değerlendirilmesi için alternatif bir yöntem olabileceği düşünülmektedir.   7. YÖNTEM: Araştırmanın amaç ve kapsamı ile uyumlu olarak, incelenmek üzere seçilen parametreler sıralanmalıdır. Bu parametrelerin incelenmesi için uygulanacak yöntem ile kullanılacak materyal ayrıntılı bir şekilde tanımlanmalıdır. Yapılacak ölçümler (ya da derlenecek veriler), kurulacak ilişkiler ayrıntılı biçimde anlatılmalıdır. (*) 7.1.İncelenecek parametrelerÇalışmada kullanılacak olan kenevir unu için yerel bir satıcıdan kenevir tohumu tedarik edilecektir. Bu tohumlar öğütülüp, elek yardımıyla elenerek belirli bir partikül boyutunda fraksiyonlanacaktır. Çalışmada kenevir unu proteinlerinin enzimatik hidrolizi adımında alkali enziminin farklı konsantrasyonları ve reaksiyon süresinin biyoaktivite üzerinde etkisi incelenerek bu parametrelerin optimizasyonu yapılacaktır. In vitro antioksidan kapasite tayininde ABTS ve DPPH yöntemi, antidiyabetik etki için ise α-glukozidaz ve maya hücresi glikoz alımı yöntemleri kullanılacaktır. Kenevir unundan farklı reaksiyon koşullarında elde edilen anlamlı biyoaktivite gösteren hidrolizat/hidrolizatların fraksiyonlanması için boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılması planlanmaktadır. Anlamlı antidiyabetik etki belirlenen hidrolizatlar ve fraksiyonlanmış hallerin tavuk embriyo modelinde etkileri belirlenecektir.7.2.Yöntem7.2.1.Kenevir unundan yağ ekstraksiyonun yapılmasıSoxhlet ekstraksiyonu (SE), Rezvankhah vd. (2016)’e göre yapılacaktır. Bu yöntemde, 20 gr öğütülmüş kenevir tohumları tartılacak ve filtre kağıdına sarılarak Soxhlet aparatına (Buchi, İsviçre) yerleştirilecektir. Ekstraksiyon, maksimum 70 °C sıcaklıkta (n-hekzanın kaynama noktası) 1:20 (w/v) oranında çözelti ile 8 saatte tamamlanacaktır. Ekstraksiyon işleminden sonra yağ fazında bulunan çözücü, bir döner vakum buharlaştırıcı (SELECTA, RS-3000V) kullanılarak 50°C'de uzaklaştırılacaktır. Özütlenen yağ, sabit bir ağırlığa ulaşana kadar 50 °C sıcaklıkta etüvde bekletilecek, çıkan yağ tartılacak ve yağ verimi hesaplanacaktır. Yağı alınmış kenevir ununda kalan hekzanın uzaklaştırma işlemi ise 50 o C ’lik etüvde bir gün tutularak yapılacaktır. Sabit tartıma gelen kenevir unu tartılarak yağsız kenevir unu verimi hesaplanacaktır. Veriler literatür ile karşılaştırılacaktır.7.2.2. Kenevir unu protein tayiniKenevir unu protein miktarlarının belirlenmesinde Kjeldahl metodu kullanılacaktır (AOAC, 1990). Bu yöntemde, protein miktarı belirlenecek örnek asit ile (H2SO4) yakılarak örnek içerisindeki azotun (NH4)2SO4’e dönüştürülmesi sağlanmakta ve açığa çıkan NH3’ün damıtılması ve standart asit çözeltisi ile titre edilmesi sonucu nötrleşmeyen asit miktarı saptanmaktadır. Analizde Kjeldahl cihazı (Gerhardt Kjeldatherm), örneklerden 1 ± 0.05 g Kjeldahl tüplerine tartılacak ve üzerine yaklaşık 3 g katalizör (1 kg susuz Na2SO4, 30 g Cu2SO4.5H2O, 15 g saf selenyum bileşiminde) eklenecektir, 13 mL H2SO4 ilavesinden sonra ise tüpler yakma ünitesine yerleştirilecek ve sıcaklık kademeli olarak 430 °C ye yükseltilecektir. Dört saat boyunca devam eden yakma işlemi sonunda tüpler soğutulup, distilasyon öncesinde üzerlerine 40 mL saf su eklenip düzeneğe yerleştirilecektir. Cihazdan (Gerhardt distilasyon ünitesi) 50 mL %40‟lık NaOH tüp içerisine alkali pompası ile verilecek ve 6 dakika sonunda oluşan destilat 25 mL borik asit içerisine toplanacaktır. Faktörü bilinen 0.1 N HCl ile destilat yeşil renkten açık pembe renge kadar titre edilecek ve kullanılan sarfiyat protein miktarı hesaplanacaktır (Jones, 1931).7.2.3.Kenevir unu protein izoaltının (KPI) hazırlanmasıKenevir unu protein izolatları Yin vd. (2008)’ e göre birkaç değişiklik ile yağı alınmış kenevir tohumu küspesinden üretilecektir. Yağı alınmış kenevir tohumu küspesi deiyonize su (1:20, w/v) içinde dispers edilecek ve dispersiyonun pH'sı 2 M NaOH ile 10.0'a ayarlanacaktır. Elde edilen dispersiyon, 37 °C'de 3 saat boyunca 300 rpm’de karıştırılacak, daha sonra bir yüksek hızlı santrifüjde (Lab Companion, UCP-02) 30 dakika boyunca 20 °C 'de 8000 g'de santrifüjlenecektir. Pelet atılacak ve süpernatant, 1 M HCl ile pH 5.0'a ayarlanacak 30 dakika boyunca oda koşullarında 300 rpm’de karıştırılarak inkübe edilecektir ve ardından 5000 g'de (Lab Companion, UCP-02) 4 °C'de 20 dakika santrifüjlenecektir. Elde edilen çökelti deiyonize su içinde yeniden çözülerek, homojenleştirilecek ve 1 M NaOH ile pH 7.0'a ayarlanacaktır. Enzimatik sindirim için dondurarak kurutma işlemi liyofilizatör (Telstar Cryodos A50) kullanılarak yapılacaktır.7.2.4. KPI’nın Protein İçeriğinin BelirlenmesiToplam protein içeriği Bicinchoninic Asit Protein (BCA Assay Kit, Sigma-Aldrich) kiti ile belirlenecektir. KPI örnekleri %0,9 NaCl çözeltisi eklenerek hazırlanacaktır. Referans eğrisi oluşturmak için bovine serum albumin kullanılacaktır. KPI örnekleri ve bovine serum albumin standartları 96’lı kuyulu mikroplakaya 25’şer µl eklenecek, üzerine BCA renk reaktifi ilave edilecek ve 37 o C’de 30 dakika boyunca inkübe edilecektir. İnkübasyon bittikten sonra 5 dakika soğutulacak ardından mikroplaka okuyucuda 562 nm’de absorbans değerleri ölçülecektir. Referans eğrisi bovine serum albumin ile oluşturulacak ve toplam protein içeriği referans eğrisine göre belirlenecektir.7.2.5. KPI'nın enzimatik hidrolizi ve hidrolizatlarının hazırlanmasıYağsız kenevir ununa enzimatik hidroliz Ren ve ark. (2016) tarafından uygulanan metotta bazı değişiklikler yapılarak uygulanacaktır. 5 g KIP 50 mg/ml'lik konsantrasyonda hazırlanmak için 100 ml damıtılmış su içinde çözülecektir ve 90 °C'de 30 dakika (pH 8.5) için ön işleme tabi tutulacaktır. Enzimlerin eklenmesinden önce, KIP çözeltisinin sıcaklığını ve pH' sını, önerilen optimum koşullara ayarlanacaktır. Alkalaz için pH 8.5, 60 °C’de KIP çözeltisine enzim/substrat oranları (E/S), 3:100, 2,5:100, 2,2:100, 1,8:100, 2:100 ve 0,8:100 (w/w) olarak eklenecektir, 2.5, 3.0, 2.5, 2.0 ve 3,0 saat boyunca 150 rpm'de çalkalamalı su banyosunda tutulacaktır. Enzimatik reaksiyonlar, biyokatalizörün 95 °C'de 10 dakika tutularak inaktive edilmesiyle sonlandırılacaktır. Ardından pH 7.0'ye ayarlanmış, elde edilen tüm hidrolizatlar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8000 g'de santrifüjlenecektir ve süpernatant dondurularak kurulacaktır. Daha sonraki analizler -18 °C'de saklanacaktır.7.2.6. Hidroliz derecesinin belirlenmesiYağsız kenevir ununa uygulanan enzimatik hidroliz sonrası proteinlerin hidroliz derecesinin belirlenmesi için Adler-Nissen (1979) ve Crowell et al. (1985) metotlarına dayanan Benjakul and Morrissey (1997) metodunda bazı modifikasyonlar yapılması veya o-ftalaldehit (OPA) metodu kullanarak belirlenmesi planlanmaktadır. Analizde enzimatik hidroliz sonrası örnekler 0,45 µm’lik fitreden geçirilecek, 1:1 oranında %1 SDS ile seyreltilerek 125 µL alınacak ve örnek üzerine 2 mL fosfat tampon (0,2125 M, pH 8,2) çözeltisi ve 1 mL %0,01 TNBS çözeltisi eklenecektir. Işık görmeyecek şekilde alüminyum folyo ile sarılan örnekler 50°C’de 30 dakika boyunca su banyosunda tutulacaktır. Süre sonunda örneklerin üzerine 2 mL 0,1 M sodyum sülfit eklenerek reaksiyon durdurulacak ve oda sıcaklığında soğutulan örneklerin 420 nm’de absorbans değerleri kör denemeye karşı sıfırlanan spektrofotometre ile okunacaktır. Analizde kör deneme, örnek yerine su konularak gerçekleştirilecektir. Standart grafik için kör çözeltisi ise, L-lösin standardı yerine %1’lik SDS çözeltisi koyularak hazırlanacaktır. Ortamda hidroliz sonucu oluşan α-amino asit miktarının belirlenmesine dayanan bu metotta, sonuçlar α-amino asit miktarının L-lösin cinsinden ifadesi ile hesaplanacaktır Bu amaçla (1-4 mM) arasında konsantrasyona sahip L-lösin çözeltileri hazırlanacak ve L-lösin konsantrasyonuna bağlı 420 nm’de absorbans değerleri okunarak standart grafik oluşturulacaktır. HD (hidroliz derecesi) aşağıdaki formül ile hesaplanacaktır;HD (%) = [(Lörnek -L0) / (Lmaks-L0)] X 100Burada; Lörnek, 30 dakika sonunda örnekte açığa çıkan α- amino asit miktarının L-lösin cinsinden değeri, Lmaks örnekteki maksimum α- amino asit miktarının L-lösin cinsinden değeri, L0 ise hidroliz öncesi örnekteki α- amino asit miktarının L-lösin cinsinden değerini belirtmektedir.Lmaks değeri için, örneklerle aynı konsantrasyonda hazırlanan protein süspansiyonu üzerine 6 N HCl eklenecektir, tüpün boş hacmindeki hava azot gazı ile uzaklaştırılarak sıkıca tüp kapatılacaktır ve 24 saat boyunca 105°C’lik etüvde tutularak tamamıyla hidroliz olması sağlanacaktır. Daha sonra örnek filtre kağıdından süzülecek ve 6 N NaOH ile nötralize edilecektir. L0 örneği ise hidroliz öncesi hazırlanan protein süspansiyonundan direkt olarak alınacaktır.Yapılan enzimatik hidrolizin verimliliği o-ftalaldehit (OPA) analizini kullanarak tespit edildiği durumda; 3 mL deiyonize su, 75 µl OPA reaktifi ile karıştırılacak ve 10 µl hidrolize edilmiş kenevir unu protein hidrolizatları yaklaşık 5 saniye çalkalanacaktır. İki dakika sonra 340 nm'de absorbans değeri okunacak ve hidroliz derecesi yüzde olarak hesaplanacaktır.7.2.7. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)Yağsız kenevir unundan elde edilen hidrolizat örneklerinin moleküler ağırlık dağılımının belirlenmesi için sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi kullanılacaktır. Analizde protein/hidrolizat örneklerinden 30 µL alınacak üzerine 10 µL SDS-PAGE yükleme çözeltisi eklenecektir. 95°C’de 10 dakika tutulacaktır. Örnekler, %12 veya %15’lik poliakrilamid jeldeki kuyulara yüklenecek, markör olarak bir kuyuya da protein markörü (Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder ve/veya Unstained Protein Ladder ve/veya BIO-RAD Unstained Polypeptide SDS-PAGE standards) yüklenecektir. Sonrasında 90 mV-15 dk. ve 110 mV-90 dk. elektroforez işlemi uygulanacaktır. İşlem sonunda jel saf su ile yıkanacak ve Coomassie Brillant Blue boya çözeltisinde bekletilecektir. Protein bantları ortaya çıktıktan sonra arka plan renginin açılarak bantların daha net görülmesi için jel, 10-15 dk. saf su ile yıkanacaktır.7.2.8. Antioksidan aktivite analizleri7.2.8.1. 2’ azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) (ABTS) serbest radikal süpürme etkisiTroloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) deneyi toplam antioksidan kapasite (TAC) tayini için ABTS yöntemi kullanılacaktır (Miller ve ark., 1993). ABTS + radikal katyonu, 7 mM ABTS ve 2,45 mM potasyum persülfatın karanlıkta oda sıcaklığında (23°C) 12-16 saat süreyle inkübasyona bırakılması ile hazırlanacaktır. 16 saat sonunda spektrofotometrede 734 nm’de ABTS çözeltisinin absorbansı metanol ile 0,7 olarak ayarlanacaktır. Kenevir unundun enzimatik hidrolizinden elde edilen hidrolizatlar ve saflaştırılmış peptitler 1:100 oranında 0,1 mg/ml konsantrasyonda olacak şekilde seyreltilecek ve 96’lık plakalara 10’ar ul örnek kuyucuklara 3 paralel olarak ekilecektir. Üzerlerine karanlık ortamda 200 µl ABTS çözeltisi eklenerek yarım saat oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edilecektir. Yarım saat sonunda elde edilen oksitlenmiş çözeltinin absorbansı, kalibre edilmiş Trolox standardının absorbansı ile karşılaştırılacaktır (Kim ve ark., 2014).7.2.8.2. 2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürme aktivitesiHorszwald ve Andlauer (2011) tarafından uygulanan “DPPH ile Trolox Eşdeğer Antioksidan Kapasitesi” adlı protokol uygulanacaktır. DPPH çözeltisi 4,1 mg DPPH tartılarak 100 ml %80 metanol içinde hazırlanacaktır. Deneme öncesi 517 nm dalga boyunda absorbans değeri 0,95 ila 1.10 aralığında ayarlanacaktır. Protein izolatları ve hidrolizatları farklı konsantrasyonlarda %80 metanol içinde çözdürülecektir. 96 kuyuluk mikroplaka kuyularına 20 µl örnek eklenerek ve üzerine 300 µl DPPH çözeltisi konulacaktır. Reaksiyon, karanlıkta 30 dakika boyunca ortam sıcaklığında gerçekleştirilecektir. 517 nm’de absorbans değerleri okunacaktır. Sonuçlar Trolox standardının absorbansı ile karşılaştırılacaktır.7.2.9.Alfa Glukozidaz Enzim İnhibisyon TestiAlfa glukozidaz enzim inhibisyon testi Telagari ve Hullatti, (2015) ve Etsassala ve ark. (2020) tarafından uygulanan yöntemde bazı modifikasyonlar yapılarak gerçekleştirilecektir.Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan izolat ve hidrolizat örnekleri ve pozitif kontrol olan akarboz %2’lik DMSO içerisinde çözülecektir. Alfa-glukozidaz enzimi (1 U/ml) ve 5 mM 4-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside substratı 0,1 M fosfat tamponu içerisinde (pH 6,9) çözülecektir. Akarboz ve örnekler 50 µl hacimde 3 paralel olacak şekilde 96’lık plakaya ekilecektir. Her bir örnek ve kontrolün üzerine 10 µl enzim, 50 µl 0,1 M fosfat tamponu eklenecek ve 37°C’de 30 rpm karanlık ortamda 15 dakika süreyle inkübe edilecektir. Ön inkübasyondan sonra, 0,1 M fosfat tamponu (pH 6,9) içerisindeki substrat 20 µl hacimde her bir kuyucuğa ilave edilecektir. Substrat ilave edildikten sonra 37°C’de 30 rpm’de karanlık ortamda 10 dakika süreyle inkübe edilecektir. İnkübasyonun ardından 50 µl 0,1 M sodyum karbonat çözeltisi ile reaksiyon durdurulacak ve 405 nm dalga boyunda mikroplaka okuyucuda absorbans okumaları gerçekleştirilecektir.7.2.10. Maya Hücresi Glikoz Alım TestiElde edilen protein izolatı ve hidrolize edilmiş örneklerin maya hücresinde glikoz alımını engelleyip engellemediğine bakılacaktır. Analizde farklı konsantrasyonlarda örnek ve pozitif kontrol olarak akarboz hazırlanacaktır. Maya hücrelerinin son hacmi %10 v/v’ lik olacak şekilde saf su ile süspanse edilecektir. Deney tüplerine 2 ‘şer ml %1 (w/v) glikoz çözeltisi eklenecek, üzerine 200 µL maya çözeltisi ilave edilecektir. Deney tüplerinin üzerine farklı konsantrasyonlardaki glikoz alımını inhibe edici özellik göstermesi beklenen örnekler 200 µL eklenecektir. Pozitif kontrol için deney tüplerine 2 ‘şer ml %1 (w/v) glikoz çözeltisi eklenecek, üzerine 200 µL maya çözeltisi ve farklı konsantrasyonlardaki akarboz çözeltileri 200 µL ilave edilecektir. Hazırlanan deney tüpleri çalkalamalı inkübatörde 37oC’de 100 rpm’ de 60 dakika boyunca belli bir eğiklikte inkübe edilecektir. İnkübasyon sonunda tüpler 4oC 3600 g’de 5 dakika santrifüj edilecek ve süpernatant kısımlar farklı deney tüplerine alınacaktır. Deney tüplerine 1 ml 0,05 M (pH 4,8) asetat tamponu konulup, üzerine 3 ml DNS çözeltisi eklenecektir. Tüpler su banyosunda 100oC içinde 10 dakika inkübasyona bırakılacaktır. Örneklerin spektrofotometrede 540 nm’de absorbans değerleri okunacaktır.7.2.11. Kenevir unu protein hidrolizatlarının fraksiyonlanmasıKenevir unundan farklı reaksiyon koşullarında elde edilen anlamlı biyoaktivite gösteren hidrolizat/hidrolizatların fraksiyonlanması amaçlanmaktadır. Tang ve ark. (2009) tarafından kenevir unundan elde ettikleri hidrolizatlara uyguladıkları boyut dışlama kromatografisi (SEC) yöntemi kullanılması planlanmaktadır. Deney, oda sıcaklığında bir Sephadex G-50 kolonu (2*100 cm) kullanılarak gerçekleştirilecektir. 50 mg/mL'lik bir konsantrasyonda hidrolizat numuneleri (2 mL) kolona yüklenecek ve 50 mmol/L fosfat tamponu (pH 7.0) ile 1 mL/dakika hızında yıkanacaktır. Örnekler, tüp başına 3 mL olarak toplanarak, örneklerin 280 nm'deki UV absorbansı ölçülecektir.7.2.12. Tavuk embriyosunda diyabet oluşturulması ve kenevir unu protein hidrolizatlarının antidiyabetik etkisinin incelenmesiDöllenmiş yumurtalar İzmir Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsünden temin edilecektir. Tavuk embriyosunda diyabet analizlerinde D-glukoz, streptozotosin, metformin, formaldehit, salin sodyum sitrat (SSC tamponu) ve PBS (fosfat tamponlu salin) tabletler kullanılacaktır.Yumurtalar 36-38 °C, %58-60 nem içeriğinde kuluçka makinasında inkübasyona bırakılacaktır. 8. Embriyonik günde (EG) canlılık kontrolleri gerçekleştirilerek ve ölü olan varsa buzdolabına kaldırılacaktır. Enjeksiyon işlemi aseptik koşullar altında gerçekleştirilecektir. Embriyonik yumurtaya verilecek maddeler PBS’te çözdürülerek ve ardından 0,45 mm gözenek çaplı şırınga filtreden geçirilerek sterilizasyon işlemi gerçekleştirilecektir. İnokülasyon işlemi gerçekleşmeden önce yumurtalara ışık altında bakılarak damarlanmanın az olduğu bölge hava boşluğunun 1-2 mm üstünden işaretleme yapılacaktır. Yumurtalar yumurtalığa 4’lü tekrarları olacak şekilde dizilecek ve kodlanacaktır. Yumurtaların üzerleri %70’lik alkol ile temizlenecek ve ucu kırılmış bir şırınga ucu ateşte steril edilecek ve işaretlenen bölgeden delik açılacaktır. Devamında her madde 4 ‘lü tekrarlı olarak 100 ul inoküle edilecektir.7.2.12.1.Plazmada insülin ve glikoz miktarını belirlemeHaselgrübler ve ark. (2017) tarafından yapılan çalışmada antidiyabetik özelliklere sahip fitokimyasalların karakterizasyonu için civciv embriyo modelini (tavuk yumurtası testi HET) kullanmışlardır. Bu metotta döllenmiş yumurtaların kuluçka süresindeki değişikliklerin etkisi belirlenmiştir. Deneylerde kullanılan maksimum embriyo yaşı 11’dir. 10 veya 11 günlük civciv embriyosu yüksek glikoz seviyeleri ile karakterizedir. İnsülin üretimi 12. günden daha erken başlamamasına rağmen insüline duyarlıdır. Buna göre, doğal olarak üretilen insülin ile 12. güne kadar uygulanan insülin mimetik bileşikler arasındaki etkileşimin olmadığı kabul edilir ve örnek toplanabilir. Bu nedenle gelişimlerinin 12. gününde civciv embriyolarının kalplerinden kan alınarak, kan şekeri ve insülin seviyeleri için örnek toplanacaktır. Kan şekeri seviyelerini ölçmek için bir glükometre kullanılacaktır. 12.günde yapılacak deneyler için 14 günden az olduğu için etik kurul izinine gerek yoktur.    (*) Doğrudan insan veya hayvanlar üzerinde yapılacak çalışmalar için ilgili birimden etik kurul onay kararının alınması zorunludur.

Detay görüntüle